大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

崔喜艳，陈众峰，范 贝，韩 琳，刘晓庆，董雅致，张治安

(吉林农业大学 a 生命科学学院，b 农学院，吉林 长春130118)

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

崔喜艳a，陈众峰a，范 贝a，韩 琳a，刘晓庆a，董雅致b，张治安b

(吉林农业大学 a 生命科学学院，b 农学院，吉林 长春130118)

【目的】 进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能，为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】 从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538 bp的DNA序列，根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置，设计含1 089，712和190 bp 3个5′ 端缺失体，并将rbcS基因启动子(1 538 bp)及3个5′ 端系列缺失体序列分别与gus基因融合，构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC，用农杆菌介导法转化烟草，通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】 克隆了1 538 bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089，712和190 bp 的5′ 端缺失体启动子片段。GUS 活性检测表明，在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高，且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当，而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明，T1代转基因烟草光下培养时，3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S 启动子相当，其中pB活性最高，是CaMV35S启动子活性的1.4 倍,pA、pC活性低于pB，分别为pB活性的84%和71%；含pA 的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达，光下萌发幼苗叶片有gus基因表达，而含有 pB、pC的转基因烟草，在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达，且表达量以pB最高。【结论】 含有长度为1 089 bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性，长度为712 bp (pB)的缺失体启动子的启动活性最高。

大豆；rbcS基因启动子；转基因烟草；功能缺失

植物基因工程研究中常用的启动子，按作用方式及功能主要分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子3类[1]，但这种分类并不是绝对的，有一些启动子往往兼有其他类型启动子的特性，如高等植物光合作用的关键酶——1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco,EC.4.1.1.39)的小亚基(rbcS)基因启动子，就兼有光诱导性和叶组织特异性[2]。Rubisco主要存在于叶绿体的间质中，占叶片可溶性蛋白的40%以上，由8个大亚基(rbcL)和8个小亚基(rbcS)组成。在Rubisco全酶中，rbcL主要起催化作用，rbcS具有调控Rubisco 活性的功能[3]。目前，已对多种植物的rbcS基因启动子进行了广泛的研究[4-6]。Marraccini等[7]证实，克隆的咖啡rbcS基因启动子能使转基因烟草中gus基因的表达具有光诱导活性和叶组织特异性。Kyozuka等[8]将水稻、烟草的rbcS基因启动子与gus基因融合并将其重新转入水稻后发现，gus基因的表达亦有光诱导活性和组织特异性。Gittins等[9]在研究大豆rbcS基因SRS1启动子时发现，SRS1启动子能驱动uidA基因在转基因苹果的光合组织中表达，同时uidA基因的表达也具有光诱导活性。综上可知，rbcS基因的启动子除具有光诱导活性外，同时亦能驱使外源基因在转基因植物的特定部位表达。

2011年,刘晓庆[10]克隆了大豆rbcS基因启动子，但未对该启动子功能进行系统研究。启动子缺失分析是研究启动子及调控元件功能的一种重要且有效的方法[11-12]，该方法先是获取一系列启动子5′端缺失体片段，然后将这些片段分别与报告基因融合构建植物表达载体，在转化的模式植物中检测报告基因活性，从而确定启动子的功能及一些调控元件的作用[13-14]。为了进一步明确栽培大豆rbcS基因启动子在转基因烟草中的功能，本研究依据克隆的栽培大豆rbcS基因启动子的DNA序列，用软件分析各调控元件所在的位置，克隆了一系列不同长度启动子5′端缺失体片段，同时将这些片段分别与gus基因融合，构建植物表达载体，用农杆菌介导法转化烟草，通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性，从而验证栽培大豆rbcS基因启动子的功能，并分离具有最大转录活性的最小启动子，旨在为植物基因工程的相关研究提供启动子资源。

1 材料与方法

1.1 材 料

大豆“吉农13”种子由吉林农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学研究室保存。取饱满的大豆种子5粒，盆栽土培于营养钵中，光照培养箱中培养，白天(26±0.5) ℃，夜晚(15±0.5) ℃，照光12 h，每天08:00-08:30浇水50 mL，取生长2周的大豆叶片，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

烟草NC89、植物表达载体pCAMBIA1301、根癌农杆菌LBA4404和含有prk2013质粒的大肠杆菌，均由吉林省农业科学院农业生物技术研究所惠赠。

DNA提取试剂盒、核酸限制性内切酶PstⅠ和NcoⅠ、Ex-Taq酶、T4DNA 连接酶、pMD18T载体和DNA分子量标准，均为TaKaRa公司产品；羟甲香豆素(4-methylumbelliferone，4-MU)、4-甲基伞形酮-β-D-葡糖醛酸苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide，MUG)，均购自北京乐博生物科技有限公司。其他试剂为国产分析纯试剂。

1.2 不同长度5′端启动子克隆及植物表达载体的构建

应用Primer 5.0软件，参照文献[10]设计rbcS基因启动子的克隆引物。引物由上海生工技术有限公司合成，纯度为PAGE级。

GmSS：5′-AACTGCAG TGTGTAGTATCA-TAGAGT-3′；

GmSP1：5′-AACTGCAG CATGCCTCACT-GCTAGAA-3′；

GmSP2：5′-AACTGCAG ACCAAGCTTGA-TAAGCCC-3′；

GmSP：5′-CATGCCATGGGCTTCTCCTT-CTTAGTTC-3′；

GmSP3S：5′-AACTGCAG GCCTCCTCCA-CGTGTCACTTC-3′；

GmSP3A：5′-CATGCCATGG TATATATA-ATAGTGTGATTTG -3′；

其中GmSS、GmSP1、GmSP2及GmSP3S带PstⅠ酶切位点CTGCAG， GmSP 和GmSP3A带NcoⅠ酶切位点CCATGG。

以大豆叶片中提取的DNA为模板，用引物GmSS/GmSP进行PCR扩增。扩增程序为：94 ℃预变性2 min ；94 ℃变性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温15 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，回收目的条带(1 538 bp,命名为GmrbcS)，与pMD18T载体连接后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取菌落，验证为阳性菌的送至上海生工技术有限公司测序。

用引物GmSP1/GmSP、GmSP2/GmSP和GmSP3S/GmSP3A进行PCR扩增。扩增程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s(退火温度分别为43，46和45 ℃)，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温15 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，回收目的条带，分别获得1 089 bp 的片段A，712 bp 的片段B和190 bp 的片段 C。将A、B、C分别与pMD18T载体连接后，转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取菌落，验证为阳性菌的送至上海生工技术有限公司测序。

用PstⅠ/NcoⅠ酶切上述 4 种不同长度的 DNA 片段，DNA凝胶回收试剂盒回收后备用(按说明书操作)。同样用PstⅠ/NcoⅠ处理植物表达载体pCAMBIA1301，与回收的 4 种不同长度的片段连接：取5 μL目的基因片段和1.5 μL pCAMBIA1301、1 μL 10×T4Ligase Buffer、0.5 μL T4Ligase，补水至10 μL，16 ℃过夜连接，构建含不同长度启动子的植物表达载体，命名为pGmrbcS、 pA、pB和pC。

1.3 烟草遗传转化

采用三亲杂交法将构建好的植物表达载体pGmrbcS、 pA、pB和 pC转入农杆菌 LBA4404。将含有植物表达载体的农杆菌LBA4404接种到 YEB 液体培养基 (含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif) 中， 过夜180 r/min 振荡培养；培养物用 YEB液体培养基按 1∶1 的体积比进行稀释，继续培养至菌液OD600值为 0.5，并利用此培养物侵染生长20～30 d、切成0.5 cm×0.5 cm的无菌烟草叶片。侵染后，将叶片摆放在共培养培养基上，28 ℃暗培养3 d。将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L Hyg+500 mg/L Cef)上进行培养，获得转基因烟草植株。收获种子后，继续培养至T1代。

1.4 转基因植株GUS 组织化学染色

随机选取苗龄5～9 d的T1代3种缺失体(pA、pB和pC)的转基因烟草叶片，切成0.6 cm×0.6 cm大小，浸入适量GUS染液中， 37 ℃避光染色4 h，沸水浴条件下用体积分数75%酒精对叶片进行脱色，除去叶绿素，数小时后观察叶片GUS的着色情况。

1.5 转基因烟草GUS活性的检测

1.5.1 GUS粗酶液的提取 取不同转基因烟草材料0.1 g于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉，加入1 mL预冷的GUS提取液(100 mmol/L PBS缓冲液(pH 8.0)、10 g/L PVP、10 mmol/L β-巯基乙醇)，制成匀浆，冰浴1 h，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，收集上清液即为粗酶液。每个样品重复3次。

1.5.2 4-MU标准曲线的制作及GUS酶活的定义 用0.2 μmol/L Na2CO3(反应终止液)将1 mmol/L 4-MU的母液稀释成不同浓度，用970CRT荧光分光光度计在发射光为465 nm、激发光为365 nm、狭缝为25 nm时，对不同浓度4-MU的荧光强度进行测定，重复3次，计算平均值后绘制标准曲线。GUS粗酶液中的总蛋白含量测定参见文献[15]的方法。

将每分钟水解4-MUG生成1 pmol 4-MU的酶量定义为1个活力单位，GUS活性用每微克总蛋白的酶活力表示，单位为pmol/(μg·min)。

1.5.3 GUS粗酶液中GUS活性的测定 取10 μL GUS粗酶液和190 μL、37 ℃预热的反应缓冲液(1 mmol/L MUG)，加入到1.5 mL的离心管中，轻微混匀，迅速取出50 μL加入到4.95 mL反应终止液中振荡混匀，此为0 min反应样品；将离心管放在37 ℃的水浴中进行酶反应，20 min后迅速取出50 μL加到4.95 mL反应终止液中振荡，混匀后作为酶反应20 min的样品。以0 min反应样品为空白对照，在发射光为465 nm、激发光为365 nm、狭缝为25 nm的条件下，对酶反应20 min样品的荧光强度进行检测。重复3次取平均值，利用4-MU标准曲线计算4-MU的含量。

1.5.4 含不同长度GmrbcS基因启动子的GUS活性检测 将转pA、pB和pC的T1代不同类型转基因烟草种子分别在黑暗和光下进行萌发， 10 d后将在黑暗中萌发的幼苗转移至光下复光培养 2 d[12]，分别随机选取3株植株，抽提其叶片中的GUS蛋白；然后对黑暗和光下生长的幼苗叶片进行GUS 定量分析，从而确定启动子的光诱导表达特性。

2 结果与分析

2.1 大豆rbcS基因启动子及缺失体启动子片段的克隆

用试剂盒提取大豆叶片基因组DNA，OD260/OD280值为1.827。以此DNA为模板，GmSS/GmSP、GmSP1/GmSP、GmSP2/GmSP和GmSP3S/GmSP3A为引物，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分别获得1 538 bp(GmrbcS)、1 089 bp(A)、712 bp(B)和190 bp(C)单一扩增带(图1)。将片段GmrbcS、A、B和C切胶回收后与pMD18T载体相连，转化后挑取阳性菌送至上海生工技术有限公司测序。测序结果的碱基比对表明，GmrbcS、A、B和C的同源性为100%。片段GmrbcS为 1 538 bp，是全长rbcS基因启动子，与刘晓庆[10]克隆的大豆rbcS基因启动子的同源性为100%，与GenBank中大豆rbcS基因启动子SRS4 (M16889.1) 的同源性为98%。表明克隆的大豆rbcS基因及缺失体启动子的DNA序列是正确的，可分别用于构建植物表达载体。

PlantCARE分析结果(图2)表明，大豆rbcS基因启动子序列共有10个GATA盒(GATA)、5个I盒(GATAAG)、1个GT-1结合位点(GGTTAA)和1个G盒(CACGTG)，为叶组织特异性的功能元件，这些元件是光诱导表达启动子和组织特异性的保守元件[16-19]；同时还含有6个启动子区和增强子区共同的顺式作用元件(CAAT)和1个TATA盒，后二者为启动子所必需。

2.2 大豆rbcS基因启动子及缺失体启动子片段植物表达载体的构建

根据光诱导调控元件及启动子顺式作用功能元件所在的位置，设计3种不同长度5′端缺失体启动子[17-19]，引物序列具体部位如图2所示，3个缺失体启动子均有叶组织特异性G盒。利用PCR方法获得rbcS基因启动子的一系列5′缺失体1 089 bp 的片段A、712 bp 的片段B、190 bp 的片段 C。利用酶切-连接的方法，将全长rbcS基因启动子及不同长度缺失体启动子与pCAMBIA1301连接构建植物表达载体，命名为pGmrbcS、pA、pB和pC。其中pA含有8个GATA盒(GATA)、4个I盒(GATAAG)、6个顺式作用元件(CAAT)、1个G盒和1个TATA盒；pB含有 6个GATA盒(GATA)、3个I盒(GATAAG)、5个顺式作用元件(CAAT)、1个G盒和1个TATA盒；pC含有1个GATA盒(GATA)、1个I盒(GATAAG)、3个顺式作用元件(CAAT)、1个G盒和1个TATA盒。缺失体表达框如图3所示。由图4可见，用PstⅠ/NcoⅠ对大豆rbcS基因启动子及不同长度缺失体启动子植物表达载体进行双酶切后，分别获得1 538，1 089，712和190 bp的片段，说明大豆rbcS基因及不同长度缺失体启动子植物表达载体构建成功。

2.3 rbcS基因启动子转基因植株的GUS活性检测

取分别转pGmrbcS、pCAMBIA1301表达载体的转基因烟草植株，对其叶、茎、根各组织进行GUS活性检测，结果如图5所示。由图5可见，在pCAMBIA1301转基因烟草的叶、茎、根中都检测到GUS活性，说明CaMV35S启动子能驱动外源基因在烟草中的表达；在pGmrbcS转基因烟草的叶中检测到较高的GUS活性且与CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当，在根、茎中只检测到微弱的GUS活性，表明栽培大豆rbcS基因启动子驱动外源基因在转基因烟草的叶片中高表达，在根、茎中表达量很低。该结果与孙家利等[2]和韩琳[15]的研究结果一致。

2.4 含不同长度5′ 端缺失体启动子转基因烟草的获得

通过农杆菌侵染的方法转化烟草叶片,分别获得含有pA、pB和pC的转基因烟草植株32、18和10株。GUS组织化学染色结果(图6)证明，rbcS基因不同长度5′ 端缺失体启动子驱动的gus基因在转基因烟草叶片中均有表达。

2.5 不同长度5′ 端缺失体rbcS基因启动子转基因烟草叶片的GUS活性检测

为了确定启动子的表达活性，选取10 株不同长度5′ 端缺失体rbcS基因启动子的转基因烟草，且GUS 组织化学检测为阳性的植株叶片进行GUS 定量分析，结果(图7)表明，启动子pA、pB和pC均表现出较高的活性，其中pB活性最高，是 CaMV35S 启动子活性的1.4 倍。其他2个启动子缺失体(pA，pC)活性较低，分别为pB活性的84%和71%，其中活性最小的pC与CaMV35S 启动子的活性差别不大。

2.6 转基因烟草中不同长度5′端缺失体rbcS基因启动子的光诱导表达特性

为检测不同长度缺失体rbcS基因启动子的光诱导表达特性，将T1代不同转基因烟草的种子分别在黑暗和光下进行萌发,10 d 后将在黑暗中萌发的幼苗转移至光下复光培养2 d，然后对黑暗和光下生长的幼苗叶片进行GUS 定量分析，以确定启动子的光诱导表达特性。结果(图8)显示，含有光诱导元件的pA转基因烟草叶片，在黑暗中萌发检测不到GUS的表达， 而在光下萌发或在黑暗中萌发后复光培养的叶片中均能检测到gus基因的表达；含有 pB、pC的转基因烟草叶片，在黑暗和光下萌发的幼苗中都能检测到gus基因的表达。以上结果说明， 只有pA启动子具有光诱导特异表达的特性，其他缺失体(pB和pC)均为组成型表达，且不受光诱导的影响。

3 讨 论

相关研究表明，大豆rbcS基因的转录具有明显的昼夜节律变化，而且这种节律变化受光照的影响[20]。说明光对光合作用相关基因的调控对植物光合作用有重要影响。通过PlantCARE在线分析启动子序列，发现本研究所克隆的rbcS基因启动子中含有多个组织特异性及光诱导的核苷酸序列，包括GT-1结合位点(GGTTAA)、I盒(GATAAG)、G盒(CACGTG)、GATA模型，该启动子序列中还含有多个顺式作用元件(CAAT)和1个TATA盒，二者为启动子所必需[16]。Green等[17]首次从豌豆rbcS-3A启动子中分离出对光敏感的GT结合位点。在黑暗状态下，GT结合位点负责关闭光调控基因的转录[18]。I盒(GATAAG)是光诱导基因上游的保守元件，Donald 等[19]采用缺失的方法分析拟南芥rbcS-1A基因启动子时发现，I盒能调节rbcS-1A基因的光诱导表达。

本试验成功克隆了1 538 bp的大豆rbcS基因启动子序列并对其进行了分析，发现其上含有许多与光诱导有关的顺式作用元件，共有10个GATA盒(GATA)、5个I盒(GATAAG)、1个GT-1结合位点(GGTTAA)和1个G盒(CACGTG)及6个启动子区与增强子区共同的顺式作用元件(CAAT)和 1个TATA盒。采用5′端缺失体构建了一系列不同长度的载体对rbcS基因启动子功能进行验证，其中pA中含有8个GATA盒(GATA)、4个I盒(GATAAG)、6个顺式作用元件(CAAT)、1个G盒和1个TATA盒；pB中有 6个GATA盒(GATA)、3个I盒(GATAAG)、5个顺式作用元件(CAAT)、1个G盒和1个TATA盒；pC中有1个GATA盒(GATA)、1个I盒(GATAAG)、3个顺式作用元件(CAAT)、1个G盒和1个TATA盒。GT-1保守序列和顺式作用元件都能调节基因受光诱导后的转录活性，随着这些元件的缺失，增强子的数量随之减少，基因的表达量都会改变[21]。

本研究结果表明，将不同长度的启动子片段与gus基因相融合并对烟草进行转化，发现在转基因烟草叶片中gus基因均有表达，不同缺失体片段的GUS活性表达差异明显。GUS 组织化学分析表明，在pGmrbcS转基因烟草叶中检测到较高的GUS活性，且与CaMV35S启动子驱动gus基因的表达量相当，而在茎、根中只检测到微弱的GUS活性；GUS定量分析表明，转基因烟草的 T1代在光下培养时，启动子pA、pB和pC驱动gus基因在烟草的叶片中均有表达,启动子pB表现出最高的活性，是 CaMV35S 启动子活性的1.4倍。通过对其进行的光诱导试验可知，光诱导相关元件能提高rbcS基因启动子驱动gus基因表达活性，随着功能元件的减小，光诱导能力随之降低。

本试验结果还表明，含有多个光诱导元件的 1 089 bp(pA)rbcS基因启动子具有光诱导和组织特异表达特性，而其他缺失体(712 bp(pB)和190 bp(pC))则仅具有组织特异性表达特性，说明了光诱导元件对光诱导型启动子的重要性。本试验克隆的rbcS基因启动子pGmrbcS及3种不同长度的rbcS基因缺失体启动子pA、pB和pC，在驱动外源gus基因表达活性上均与CaMV35S启动子相当，该4种启动子可用于植物基因工程的相关研究，也可为进一步深入探讨rbcS基因启动子调控Rubisco表达的分子机制提供理论参考。

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Cloning ofrbcSgene promoter fromGlycinemaxand dysfunctional analysis in transgenic tobacco

CUI Xi-yana,CHEN Zhong-fenga,FAN Beia,HAN Lina,LIU Xiao-qinga,DONG Ya-zhib,ZHANG Zhi-anb

(aSchoolofLifeSciences,bCollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study aimed to verify the function ofrbcSgene promoter of soybean and provide resource for plant genetic engineering.【Method】 Sequence of a 5′-upstream DNA segment (1 538 bp) ofrbcSgene from soybean was cloned.Based on location of light-inducible regulatory element and cis-acting functional element, three 5′-end series deletions with lengths of 1 089,712 and 190 bp were constructed and fused withgusgene in addition torbcSpromoter to form expression vectors of pA,pB,pC and pGmrbcS,respectively.All vectors were transformed into tobacco with theAgrobacterium-mediated method and expression characters of different deletions were detected through the change ofgusgene activity.【Result】 Promoter sequence (1 538 bp) ofrbcSgene from soybean and three 5′-end deletion promoters with lengths of 1 089,712 and 190 bp were cloned.GUS activity detection shows that the highest GUS activity was detected in transgenic tobacco leaves with pGmrbcS,similar to that ofgusgene driven by CaMV35S promoter in transgenic tobacco leaves of pCAMBIA1301.Weak GUS activity was detected in stem and root.GUS quantitative analysis shows that the expression activities of three deletion promoters in leaves were similar to that of CaMV35S promoter when T1progeny seeds of transgenic tobacco were cultured with light.pB had the highest activity,which was 1.4 times of that of CaMV35S.The activities of pA and pC were 84% and 71% of that of pB.Expression ofguswas detected in the leaves of transgenic tobacco seedling with pA cultured with light while it was not in the dark.Expression ofguswas detected in the leaves of transgenic tobacco seedling with pB and pC cultured in both dark and light and the expression in pB was highest.【Conclusion】 TherbcSgene deletion promoter with length of 1 089 bp containing light-inducible element (pA) was light inducible and expressed tissue-specific character,and the deletion promoter with length of 712 bp (pB) had the highest activity.

Glycinemax;rbcSgene promoter;transgenic tobacco;function deletion

2014-07-24

国家自然科学基金项目(31171459)；吉林省自然科学基金项目(201215178)

崔喜艳(1971-)，女(达斡尔族)，吉林长春人，副教授，博士，主要从事植物基因工程研究。 E-mail:cuixiyan2005@163.com

张治安(1964-)，男，吉林长春人，教授，博士生导师，主要从事作物生理生态研究。E-mail:zhangzhian6412@163.com

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.005

S565.103.4；Q943.2

A

1671-9387(2015)05-0114-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.005.html