牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

黄 偲，兰道亮，林宝山，陈亚冰，王树茂，李 键,

(西南民族大学 a 生命科学与技术学院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

黄 偲a，兰道亮b，林宝山a，陈亚冰a，王树茂a，李 键a,b

(西南民族大学 a 生命科学与技术学院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

【目的】 对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析，为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】 参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物，提取牦牛肝组织RNA，以反转录合成的cDNA为模版，克隆牦牛Cygb基因并进行测序，运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】 牦牛Cygb基因编码区全长573 bp，编码190个氨基酸，编码产物分子质量21.5 ku，理论等电点为6.61。蛋白预测表明，Cygb编码蛋白整体表现为亲水性，蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明，11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性，在系统发育树中距离最近，其中牦牛与牛的同源性最高，达到99.0%。【结论】 克隆到573 bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列，该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。

牦牛；Cygb基因；克隆；序列分析

细胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb)是在脊椎动物体内已发现的5 种携氧球蛋白之一，与血红蛋白(Haemoglobin，Hb)、肌红蛋白(Myoglobin，Mb)和脑红蛋白(Neuroglobin，Ngb) 共同组成“珠蛋白超家族(Globin superfamily)”，球蛋白X(Globin X，GbX)作为第五类型的脊椎动物的球蛋白，只存在于鱼类和两栖类动物中[1]。Cygb几乎存在于脊椎动物的所有体细胞内[2-3]，具有与经典珠蛋白Hb和Mb不同的“六配位”血红素-铁配位形式，使之具备在缺氧或器官纤维化时表达升高的特性[4]。Cygb主要分布于结缔组织成纤维细胞、肝星形细胞、成软骨细胞和成骨细胞中， 定位于胞质，亦分布于神经系统的某些特殊神经细胞亚群及视网膜的某些特殊类型细胞内，且定位于胞质和胞核中[5]。

经典珠蛋白Hb和Mb的结构、功能与进化等已研究得相当深入，而Cygb和Ngb的相关研究主要集中在临床医学方面，对于环境适应性方面作用的研究仍处于初级阶段。目前的研究认为，Cygb除具有与珠蛋白超家族成员都有的运输和储存氧气、维持细胞氧化代谢的功能外，还具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶活性以及NO清道夫和参与胶原合成等功能，且其表达在缺氧或器官纤维化时表现出升高特性[6-8]。进一步研究显示，该特性与低缺氧适应性和胶原代谢有关，可能为动物机体低氧适应性研究及相关疾病的诊断治疗提供了新思路。Cygb在脑部特定区域神经细胞的细胞质和细胞核都有分布，能够受脑缺氧的诱导。体内、体外试验均表明，其在缺氧情况下表达上调，能增加脑组织对缺氧的耐受能力，抵抗氧化应激所导致的损伤[9]。细胞珠蛋白对肝星状细胞氧化损伤也具有显著性保护作用[10]。此外，有关试验证实，大鼠皮肤切创后，创周皮肤Cygb基因的 mRNA表达随损伤时间而呈规律性变化，其时序性变化规律可望作为皮肤损伤经历时间推断的客观指标[11]。目前，关于Cygb的研究主要集中在临床医学领域，而对于其在环境适应性上的研究尚比较少。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高原环境下的特有物种，其机体早已适应高海拔低缺氧环境，目前尚未见到牦牛Cygb基因的相关报道，本试验通过RT-PCR技术首次克隆并得到牦牛Cygb基因的全长编码区，对获得的目的基因进行了序列分析，旨在为进一步探明Cygb在牦牛适应高原低氧环境中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂

本试验所用的安多牦牛肝脏组织，采自甘肃甘南藏族自治州夏河县。

本试验所用普通PCR仪、电泳仪、琼脂糖凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司，LATaqDNA聚合酶、大肠埃希菌DH5α购自天根生化科技(北京)有限公司，pMD19-T克隆载体购自TaKaRa(大连)有限公司，Trizol购自Invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自Fermentas公司，凝胶回收试剂盒购自Axygen(北京)公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中登录的牛(Bostaurus)cytoglobin基因Cygb序列(GenBank登录号为：NM_001206720.1)，用Premier 5.0软件设计1对引物，引物序列与预期扩增片段长度如表1。引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 牦牛肝脏组织RNA的提取和cDNA的合成 取牦牛肝脏组织100 mg，置于研钵中，迅速加入1 mL Trizol，后加入液氮进行研磨提取总RNA。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，将RNA反转录合成cDNA第一链。反转录体系为20 μL：oligo dT181 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μL) 1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH2O补足20 μL。反转录程序为：42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min。合成cDNA并于-20 ℃保存备用。

1.2.3 牦牛Cygb基因的克隆和测序 以牦牛肝脏组织cDNA为模板，引物为Cygb-F和Cygb-R。反应体系为：cDNA 1 μL，2×TaqMasteMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，双蒸水10 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，Axygen凝胶回收试剂盒回收纯化目的产物。

将PCR产物连接pMD18-T载体，连接反应体系为：pMD18-T Vector 0.5 μL，Ligate Mix 5 μL，胶回收DNA 4.5 μL，用灭菌水补足至10 μL，16 ℃反应16 h。连接产物转化DH5α感受态细胞并在青霉素(Amp)琼脂平板上涂板，37 ℃培养16 h，挑选单菌落，重悬于10 μL灭菌水中，以次菌液为模板，反应程序和条件同上，进行菌液PCR鉴定，确定阳性克隆菌液，从中筛选3个接种于20 mL的LB液体培养基中(Amp，100 μg/mL)，37 ℃振荡培养16 h，取菌液800 μL于1.5 mL灭菌离心管，送往Invitrogen(上海)公司测序。

1.2.4 牦牛Cygb基因的序列分析 利用Expasy在线软件对其基本理化性质进行分析；利用DNAStar软件对基因编码产物亲/疏水性、柔韧性/抗原性进行预测；运用在线软件PBIL LYON-GERLAND对Cygb基因编码的蛋白质二级结构进行预测；利用DNAStar软件子程序MegAlign的Clustal W方法与GenBank中公布的部分物种Cygb基因序列进行同源性比较；利用MEGA 5.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 牦牛Cygb基因的扩增

牦牛Cygb基因扩增结果(图1)显示，扩增片段大小为573 bp，与预期扩增片段大小相符。

2.2 牦牛Cygb基因的基本理化性质

扩增得到牦牛Cygb基因编码区全长为573 bp(GenBank登录号为：KF425757)，利用Expasy等生物信息学在线软件对其基本理化性质的分析结果显示，Cygb基因开放阅读框全长573 bp，编码190个氨基酸，编码产物分子质量为21.5 ku，理论等电点为6.61。氨基酸组成中，正电荷残基为24个，负电荷残基为25个，整个蛋白带负电荷。

2.3 牦牛Cygb基因编码产物亲/疏水性、柔韧性/抗原性预测

用DNAStar软件子程序Prostean对Cygb基因编码产物的亲/疏水性、柔韧性/抗原性进行预测，结果显示，Cygb基因编码产物的亲水性残基所占比例大于疏水性残基，因此推测其编码蛋白整体表现为亲水性[12]。

2.4 牦牛Cygb基因编码蛋白质二级结构预测

应用在线软件PBIL LYON-GERLAND预测组成Cygb多肽链二级结构的3种类型，表明α螺旋、延伸链和自由卷曲的比例为48.42∶34.74∶16.84，说明该蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链2种结构元件组成，自由卷曲相对较少，β螺旋则散布于整个蛋白质中。

2.5 牦牛与其他物种Cygb基因的同源性

利用DNAStar软件子程序MegAlign的Clustal W方法，与GenBank中公布的部分物种Cygb基因序列的同源性和差异性进行比较，结果如表2所示。

注：1.牦牛;2.黑猩猩;3.家犬;4.家鼠;5.斑马鱼;6.猕猴;7.绵羊;8.牛;9.人;10.原鸡;11.爪蟾。对角线上为同源性数据，下为差异性数据。

Note:1.Yak;2.Pantroqlodytes;3.Canislupusfamiliaris;4.Musmusculus;5.Daniorerio;6.Macacamulatta;7.Ovisaries;8.Bostaurus;9.Homosapiens;10.Gallusgallus;11.Xenopuslaevis.Homologous data is above the diagonal and below is divergent data.

表2表明，牦牛Cygb基因序列与其他10个物种相比，同源性最高的是牛，高达99.0%；最低的是斑马鱼，为57.4%；与家犬、人、猕猴、绵羊、黑猩猩、家鼠的同源性都高于90%；与原鸡、爪蟾的同源性分别为76.7%和67.7%。差异性分析结果表明，牦牛Cygb基因序列与黄牛差异性最小，仅为1.1%，与其他哺乳动物的差异性也低于10%。上述结果说明，Cygb基因在哺乳动物间具有较高的保守性。

2.6 牦牛Cygb基因的系统进化分析

用MEGA 5.0软件的Neighbor-Joining法，重复1 000次，用获得的11个Cygb基因核苷酸序列构建Bootstrap验证的系统发育树，结果如图2所示。由图2可见，牦牛与牛Cygb基因的亲缘关系最近，并与绵羊、人、黑猩猩、家犬、家鼠形成哺乳动物的一个分支，原鸡代表的鸟类和爪蟾代表的两栖动物形成一个与牦牛遗传距离较远的分支，而斑马鱼代表的鱼类与牦牛的遗传距离最远。

3 讨 论

本研究利用生物信息学相关软件对所得序列进行分析，结果显示牦牛Cygb的mRNA序列与牛的同源性为99%，且1%的碱基不同并未导致氨基酸序列的改变，同时与其他哺乳动物的同源性也达到90%以上，这说明在牦牛近缘物种，甚至整个哺乳动物中Cygb都具有较高的保守性。由此推测，该基因应当具有非常重要的生理功能，其表达的蛋白质对于不同物种都有重要意义[13]。此外，牦牛与牛、绵羊等生长于具有显著海拔差异地区的不同物种在Cygb基因上表现出的高同源性也表明，如果该基因的表达确实引起了牦牛对于低氧环境的良好适应性，那么决定因素应存在于编码区外。Fordel等[11]的研究证实：Cygb的上游区段含有一个启动子，包含有缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)和能与HIF-1特异性结合位点起作用的缺氧反应原件(Hypoxia-responsive elements，HRES)。在缺氧条件下，Cygb受缺氧诱导，表达明显上调[14-15]。本研究对牦牛Cygb基因进行了克隆和序列分析，为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应中的作用奠定了基础。后续试验可以对不同氧分压下生活的同种牦牛各主要器官的Cygb表达量进行定量分析，并与不同海拔近缘动物进行对比，以确定Cygb基因的表达是否存在明显差异性，从而有望进一步揭示Cygb基因对动物低氧环境适应性的意义。

[1] Anja R,Christine F,Thomas H,et al.A globin gene of ancient evolutionary origin in lower vertebrates:Evidence for two distinct globin families in animals [J].Mol Biol Evol,2005,22(1):12-20.

[2] Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et al.A vertebrate glob in expressed in the brain [J].Nature,2000,407(6803):520-523.

[3] Burmester T,Ebner B,Weich B,et al.Cytoglobin:A novel globin type ubiquitously expressed in vertebrate tissues [J].Mol Biol Evol,2002,19(4):416-421.

[4] 秦豪杰，陈宝生.大鼠皮肤切创愈合过程中Cygb及HIF-1αmRNA的表达 [J].中国法医学杂志,2013,28(1):8-10.

Qin H J,Chen B S.Expressions ofcytoglobinandHIF-1αmRNA during skin incised wound healing in rats [J].Chinese Journal of Forensic Medicine,2013,28(1):8-10.(in Chinese)

[5] 杜显刚,官 鹏,陈雪梅,等.脑红蛋白在大鼠体内的分布 [J].中国法医学杂志,2005,20(5):260-262.

Du X G,Guan P,Chen X M,et al.An immunohistochemical study on the distribution of neuroglobin in rat tissues [J].Chinese Journal of Forensic Medicine,2005,20(5):260-262.(in Chinese)

[6] 贾晓健,张玉彬.胞红蛋白的结构功能与药理学活性研究进展 [J].药物生物技术,2010,17(3):268-272.

Jia X J,Zhang Y B.Recent advances in structure, function and pharmacological activity of cytoglobin [J].Pharmaceutical Biotechnology,2010,17(3):268-272.(in Chinese)

[7] Xu R,Harrison P,Chen M,et al.Cytoglobin over expression protects against damage-induced fibrosis [J].Molecular Therapy,2006,13:1093.

[8] Shaw R J,Omar M M,Rokadiya S,et al.Cytoglobin is up-regulated by promoter hypoxia and silenced by promoter hy-permethylation in head and neck cancer [J].Br J Cancer,2009,101(1):139.

[9] 田树凤，杨汉华.细胞红蛋白在缺氧性脑损伤中的研究进展 [J].现代生物医学进展,2013,13(13):2578-2580.

Tian S F,Yang H H.Research progression of cytoglobin during hypoxia brain injury [J].Progress in Modern Biomedicine,2013,13(13):2578-2580.(in Chinese)

[10] 张 潇,史雪川.细胞红蛋白表达及调控的研究 [J].临床和实验医学杂志,2011,10(3):220-222.

Zhang X,Shi X C.Research development of cytoglobin’s expression and regulation [J].Journal of Clinical and Experimental Medicine,2011,10(3):220-222.(in Chinese)

[11] Fordel E,Geuens E,Dewilde S,et al.Hypoxia/ischemia and the regulation of neuroglobin and cytoglobin expression [J].IUBMB Life,2004,56(11212):681-687.

[12] 原金钱,路义鑫,韩彩霞,等.本地毛形线虫HSP70基因的克隆与序列分析 [J].中国兽医科学,2007,37(12):1062-1065.

Yuan J Q,Lu Y X,Han C X,et al.Cloning and sequence analysis ofHSP70 gene from trichinella native [J].Veterinary Science in China,2007,37(12):1062-1065.(in Chinese)

[13] Ostojic J,Grozdanic S D,Syed N A,et al.Trent JT 3rd patterns of distribution of oxygen-binding globins,neuroglobin and cytoglobin in human retina [J].Arch Ophthalmia,2008,126(11):1530-1536.

[14] Shivapurkar N,Stastny V,Okumura N,et al.Cytoglobin,the newest member of the globin family,functions as a tumor suppressor gene [J].Cancer Res,2008,68(18):7448-7456.

[15] Guo X,Philipsen S,Tan-UnK C.Study of thehypoxia-dependeregulation of humanCYGBgene [J].Biochemical Biophysical Research Cammunications,2007,364(1):145-150.

Cloning and sequence analysis of cytoglobin gene in Yak

HUANG Caia,LAN Dao-liangb,LIN Bao-shana,CHEN Ya-binga,WANG Shu-maoa,LI Jiana,b

(aCollegeofLifeScienceandTechnology,bCollegeofTibetanPlateauResearch,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

【Objective】 This study cloned and analysed sequence of yak cytoglobin gene to improve the further study ofCygbgene.【Method】 Based on the cygb gene sequence of bovine in GenBank,primers were designed to cloneCygbgene from yak.RNA from yak liver was extracted and cDNA synthesized by reverse transcription reaction was used as cloning template.Then theCygegene was cloned and sequenced.【Result】 The length of the clonedCygbcDNA was 573 bp with a peptide of 190 amino acids,the molecular weight of 21.5 ku and pI of 6.61.Protein prediction showed that Cygb protein was hydrophilic and the secondary structure of its protein were mainly alpha helix and extended strand.Sequence homology analysis shows that yak had higher homology withBostaurus,Ovisariesand other mammals among the 11 sequences.The gene sequence of yak andBostaurushad the highest homology of 99.0%.【Conclusion】 TheCygbcDNA (573 bp) was cloned and its sequence was very conservative in mammals.

yak;Cygbgene;cloning;sequence analysis

2013-12-13

西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2014SZ97)

黄 偲(1989-)，男，湖南株洲人，在读硕士，主要从事高原动物生理学研究。E-mail:376960915@qq.com

李 键(1967-)，男，四川理县人，教授，博士，主要从事动物生殖调控研究。E-mail:lijian@swun.cn

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.014

S823.8+52

A

1671-9387(2015)05-0007-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.014.html