催产素和苯甲酸雌二醇对小尾寒羊外周血淋巴细胞增殖的影响

徐厚英，周 博，李胜利，杨立军，李创宏，李新平

(1西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2 国家动物营养学重点实验室，北京 100083)

催产素和苯甲酸雌二醇对小尾寒羊外周血淋巴细胞增殖的影响

徐厚英1，周 博1，李胜利2，杨立军1，李创宏1，李新平1

(1西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2 国家动物营养学重点实验室，北京 100083)

【目的】 研究催产素(OXT)和苯甲酸雌二醇(E2)对淋巴细胞增殖的影响，探讨OXT和E2的相互作用机制。【方法】 分别以静息和Con A刺激下的雌性绵羊外周血淋巴细胞为研究对象，用不同质量浓度(低质量浓度(OXT 10 ng/mL，E2 50 pg/mL)、中质量浓度(OXT 100 ng/mL，E2 500 pg/mL)和高质量浓度(OXT 1 000 ng/mL，E2 5 000 pg/mL))和处理方式(单用、联用(二者同时加入、E2预处理12 h后加OXT、OXT预处理12 h后加E2))的OXT、E2处理细胞，用MTT试验检测淋巴细胞的增殖水平，评估雌激素、催产素的相互作用方式。【结果】 OXT对活化和静息状态的淋巴细胞均有抑制作用，且呈剂量依赖性。低质量浓度的E2可促进Con A刺激的T淋巴细胞增殖，但对静息状态的淋巴细胞无明显影响；随E2质量浓度的增加，高质量浓度的E2对不同状态的淋巴细胞增殖均有抑制作用。低质量浓度OXT和E2联用条件下，Con A活化的T淋巴细胞的刺激指数(SI)值介于2种激素单独作用之间；静息状态下的淋巴细胞增殖明显受到抑制，该抑制作用均强于2种激素单独作用；用生理浓度的OXT(10 ng/mL)和E2(50 pg/mL)对活化状态的淋巴细胞分别进行先后处理，对不同状态淋巴细胞增殖的影响偏向于后加入的激素的作用。【结论】 高质量浓度的E2可抑制静息和Con A刺激活化的淋巴细胞的增殖，低质量浓度的E2对Con A刺激活化的淋巴细胞增殖有促进作用，而OXT抑制淋巴细胞的增殖。高质量浓度OXT和E2联用，在静息状态的淋巴细胞上体现了协同作用；低质量浓度OXT和E2联用，在活化状态的淋巴细胞上体现了相互颉颃和“利他作用”2种作用模式，显示了二者相互作用方式的多样性。

催产素；苯甲酸雌二醇；外周血淋巴细胞；MTT试验；小尾寒羊

雌激素是一种在女性性征形成和生殖过程中发挥至关重要作用的激素。雌激素在靶组织细胞中与雌激素受体结合(ER)，不仅影响乳房和子宫，而且影响大脑、骨骼、肝脏、心脏和其他组织。近年来的研究表明，雌激素对免疫系统也发挥着重要的调节作用。在先天免疫和适应性免疫系统中，女性比男性更抗感染，对疫苗具有更强的体液免疫反应，并且比男性有更多的移植排斥反应[1]。树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等都表达雌激素受体，表明雌激素对这些细胞的功能具有调节作用[2]。催产素(OXT)是一种由下丘脑产生的九肽，通过神经分泌囊泡运输到脑垂体后叶，经特定刺激后储存或释放到血液循环中。OXT主要的内分泌功能包括分娩过程中的子宫收缩和促使乳腺排乳[3]。大量证据表明，在动物模型中，催产素具有调节免疫和炎症反应的作用。催产素能表现出抗炎作用，抵消败血症所致的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)增多，并防止多个器官受到损害[4]。

雌激素和催产素既然对免疫和炎症反应都能进行调节，那么二者之间是否存在某种关系？本研究以小尾寒羊外周血淋巴细胞为研究对象，通过淋巴细胞增殖试验，探讨雌激素和催产素对淋巴细胞增殖的影响，研究雌激素和催产素之间的相互关系，为进一步阐明雌激素和催产素的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 发育正常且健康状况良好的成年雌性小尾寒羊，由西北农林科技大学实验动物中心饲养管理并提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 催产素(OXT)和苯甲酸雌二醇(E2)注射液，购自哈尔滨三马兽药业有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)，购自美国Gibco公司；MTT、L-谷氨酰胺，由美国Sigma公司提供，其中MTT用pH 7.2的PBS缓冲液配成5 g/L的溶液备用；刀豆蛋白(Con A)、肝素钠、人淋巴细胞分离液，购自北京索莱宝公司；DMSO，购自美国Amerco公司。酶标仪BIO-RAD680，美国BIO-RAD公司产品。

1.2 绵羊外周血淋巴细胞的分离

无菌采集试验羊静脉血20 mL，用密度梯度离心法[5]分离出外周血淋巴细胞，调整细胞浓度为 3×106个/mL，PBS稀释10倍，台盼蓝染色后观察细胞活力。

1.3 OXT和E2对绵羊外周血淋巴细胞的影响

1.3.1 对静息状态淋巴细胞的影响 将上述静息状态下的淋巴细胞悬液接种于96孔细胞培养板(美国康宁)，每孔100 μL(3×105个/孔)，进行OXT和E2处理。试验设空白对照组(1640培养液组)、细胞对照组(静息状态下的淋巴细胞组)、OXT组、E2组，加入刺激药物后补足终体积至200 μL，每组5个复孔，所有处理均进行3次独立试验。OXT的终浓度为10，100和1 000 ng/mL，E2的终浓度为50，500和5 000 pg/mL，分别为低质量浓度、中质量浓度和高质量浓度试验组。

1.3.2 对Con A 刺激活化的T淋巴细胞的影响 试验方法同1.3.1，只是细胞改为18 μg/mL Con A刺激的T淋巴细胞；细胞对照组为Con A刺激的T淋巴细胞；OXT的质量浓度设10，100和1 000 ng/mL，E2的质量浓度设5，50，500和5 000 pg/mL。

1.4 OXT和E2联用对绵羊外周血淋巴细胞增殖的影响

1.4.1 对静息状态淋巴细胞的影响 试验方法同1.3.1，试验设空白对照组(1640培养液组)、细胞对照组(静息状态下的淋巴细胞组)、OXT组、E2组、OXT与E2联用组。根据1.3的试验结果，OXT的终浓度设1 000 ng/mL，E2的终浓度设5 000 pg/mL，均为高质量浓度。OXT和E2联用组又设时间因素，即二者共同加入(OXT+E2)、先加入OXT作用12 h后再加入E2(12 h OXT+E2)、先用E2处理12 h后再加入OXT(12 h E2+OXT)，观察OXT与E2的相互作用。

1.4.2 对Con A 刺激活化的T淋巴细胞的影响 试验方法同1.4.1，只是细胞改为18 μg/mL Con A刺激的T淋巴细胞，细胞对照组为Con A刺激的T淋巴细胞。OXT的终浓度为10 ng/mL，E2的终浓度为50 pg/mL。

1.5 MTT试验

经过上述处理后，将供试细胞于37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度条件下培养48 h，每孔中加入终浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃继续培养4 h，小心弃去培养液，加入150 μL DMSO，在490 nm波长下测定吸光度值，计算刺激指数(SI)：SI=(试验组细胞吸光值-空白对照组细胞吸光值)/(对照组细胞吸光值-空白对照组细胞吸光值) 。

1.6 统计分析

采用SPSS 18.0软件对试验数据进行方差分析，P<0.05表示差异显著性。

2 结果与分析

2.1 OXT和E2对绵羊外周血静息淋巴细胞增殖的影响

图1结果表明，随着质量浓度的增加，OXT 和E2对绵羊静息淋巴细胞增殖的抑制作用逐渐增强，表现出剂量依赖性，低、中质量浓度OXT和E2对静息淋巴细胞增殖影响不显著，但高质量浓度OXT 和E2对淋巴细胞增殖的抑制作用分别达极显著和显著水平。高质量浓度OXT(1 000 ng/mL) 对绵羊静息淋巴细胞增殖的抑制作用显著大于E2(5 000 pg/mL)，提示OXT对淋巴细胞的抑制作用较E2强。

2.2 OXT和E2对Con A刺激的绵羊外周血T淋巴细胞增殖的影响

图2结果表明，不同质量浓度的OXT对活化状态的绵羊T淋巴细胞均有抑制作用，且随着OXT质量浓度的增高，其抑制作用逐渐增大，当OXT质量浓度为10～1 000 ng/mL时，与对照的差异分别达显著和极显著水平，并表现出剂量依赖性。E2对活化的绵羊T淋巴细胞增殖的影响随其质量浓度的变化而存在差异， 5 pg/mL E2对淋巴细胞增殖无影响， 50 pg/mL(E2处于生理浓度)E2对T淋巴细胞增殖有显著的刺激作用，500 pg/mL E2对淋巴细胞增殖有轻微的抑制作用，而5 000 pg/mL E2则对淋巴细胞增殖表现出极显著的抑制作用。

2.3 OXT和E2联用对绵羊外周血淋巴细胞增殖的影响

图3-A表明，高质量浓度OXT和E2(OXT 1 000 ng/mL，E2 5 000 pg/mL)联用对静息状态下的淋巴细胞表现出明显的抑制作用，且这种抑制作用较OXT和E2单独使用时的抑制作用强，二者之间表现出协同作用。图3-B表明，生理质量浓度下(OXT 10 ng/mL，E2 50 pg/mL)，OXT和E2联用对Con A活化的T淋巴细胞表现出颉颃作用，OXT的抑制作用和E2的刺激作用均有所降低，相互抵消了各自的一部分作用；12 h OXT+E2对淋巴细胞的增殖表现出刺激作用，与E2单独作用时表现一致；12 h E2+OXT对淋巴细胞的增殖表现出抑制作用，且与OXT单独作用时一致。笔者推测，OXT和E2可能互相促进了对方受体的表达，也即二者表现出“利他作用”。OXT和E2之间不同的作用方式与细胞状态、激素的质量浓度及激素的处理先后有关。由此推测，不同种类、质量浓度和作用方式的激素对处于不同时间、空间状态的细胞发挥作用时，可能会产生不同的结果。

3 讨 论

已知性激素除了对性分化和生殖发挥作用外，还可调节免疫反应[6]。有结果显示，在免疫功能上女性比男性具有较高的免疫球蛋白水平和较强的免疫反应[7]，同时女性对自身免疫性疾病也表现出较强的易感性[8]。本研究发现，在静息状态下，低质量浓度的E2对淋巴细胞增殖无影响，但随着质量浓度的增加，其对淋巴细胞的增殖显示出抑制作用。Gilbody等[9]发现，雌二醇对大鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的数量和质量有抑制作用，而且有剂量依赖性。Milica等[10]进一步证实，切除大鼠卵巢可促进外周血T淋巴细胞的增殖和机体的免疫反应。在Con A刺激下，低质量浓度的E2(50 pg/mL)在激活状态下可显著促进T淋巴细胞的增殖，这与Hofmann等[11]对猫外周血淋巴细胞凋亡机制的研究结果一致。Gilbody等[9]的体外试验也证明，E2可提高Con A的刺激作用。高质量浓度的E2对淋巴细胞表现出抑制作用。Jenkins等[12]证明，17β-雌二醇可以剂量依赖的方式诱导Jurkat淋巴细胞的凋亡。Zajchowski等[13]的体外试验发现，高于生理浓度的E2可诱导淋巴细胞凋亡。E2具有免疫抑制及免疫刺激双重作用，提示E2对淋巴细胞的作用不仅具有剂量依赖性，而且与细胞状态有关。这种双向作用可能是E2与ERα/β通过和脚手架蛋白分子经不同信号通路产生的[14]。对系统性红斑狼疮(SLE)的研究发现，E2可以下调 SLE患者活化T细胞内凋亡分子FasL的表达，抑制PMA诱导的SLE患者T细胞的凋亡[15]。因此E2可能通过对淋巴细胞的调控参与自身免疫疾病，但具体机制尚不明确。由此可以推测，E2可能并不是女性对自身免疫性疾病易感的罪魁祸首，即E2不会引起女性自身免疫性疾病的发生，而可能是在机体免疫功能激惹时，其可促进免疫功能紊乱，进而导致疾病的发生和发展。

OXT和E2均对女性的母性行为发挥着重要的作用，借助于淋巴细胞能否发现E2和OXT之间相互作用的新方式，这很让人期待。低质量浓度的E2和OXT同时加入活化状态的T淋巴细胞中，E2和OXT发挥了各自的作用，T淋巴细胞的刺激指数(SI)值介于E2和OXT单独作用时的SI之间，提示E2和OXT之间存在相互颉颃作用，这与传统的观点[19]不太一致；而静息状态下，二者同时加入表现出相互协同的作用，对淋巴细胞增殖的抑制作用较2种激素各自单独使用时强。E2预处理Con A活化的T淋巴细胞12 h后，再加入OXT，T淋巴细胞的增殖受到抑制，抑制程度与单独使用OXT的处理结果相似；OXT预处理Con A活化的T淋巴细胞12 h后，再加入E2刺激淋巴细胞增殖，刺激作用与E2单独作用的结果一致。笔者对雄性绵羊外周血淋巴细胞进行了同样处理，得到的结果与雌性绵羊一致，说明E2和OXT在不同性别机体内的作用方式可能一致。Insel等[20]也观察到了这样的结果。笔者推测，OXT和E2可能互相促进了对方受体的表达，这种现象体现了二者的“利他行为”[21]。这种行为不仅人、鼠存在，在其他动物中也存在，如在绵羊[22]上也发现了这种行为。Mccarthy等[23]证实，预处理E2能够提高OXT的抗焦虑作用，而且还能够加强OXT的母性行为，同时OXT也能促进E2的亲昵行为。

利他行为是一种社会行为，OXT能够调节这种行为[22]，因此其是一种极为重要的社会激素[24]。OXT通过神经系统发挥作用[25]，与OXT受体有关[26]。已有报道指出，E2可显著增加牛T淋巴细胞OXT受体 mRNA 的表达[27]。而E2对社会行为的影响可通过增加OXT的表达来产生[28]，也有可能是提高了OXT与其受体的结合。对新生草原田鼠的研究发现，产后早期OXT可显著增加下丘脑雌激素受体α(ERα)mRNA的表达[29]；Yamamoto等[30]的研究也发现，OXT可促进新生儿发育阶段ERα mRNA的表达。

[1] Verthelyi D.Sex hormones as immunomodulators in health and disease [J].Int Immunopharmacology,2001,1(6):983-993.

[2] Verthelyi D.Female’s heightened immune status:Estrogen,T cells,and inducible nitric oxide synthase in the balance [J].Endocrinology,2006,147(2):659-661.

[3] Fuchs A R,Fuchs F,Husslein P,et al.Oxytocin receptors in the human uterus during pregnancy and parturition [J].Am J Obstet Gynecol,1984,150(6):734.

[4] Detillion C E,Craft T K,Glasper E R,et al.Social facilitation of wound healing [J].Psyhoneuroendocrinology,2004,29:1004-1011.

[5] 陈肃标,谢素和,曾庆馀.提高外周血淋巴细胞梯度离心分离率 [J].汕头大学医学院学报,2001,14(2):135-137.

Chen S B,Xie S H,Zeng Q Y.Improve the separation rate of gradient centrifugation of peripheral blood lymphocytes [J].Journal of Shantou University Medical College,2001,14(2):135-137.(in Chinese)

[7] Gruber C J,Tschugguel W,Schneeberger C,et al.Production and actions of estrogens [J].N Engl J Med,2002,346(5):340-352.

[8] Fairweather D L,Rose N R.Women and autoimmune diseases [J].Emerg Infect Dis,2004,10(11):2005.

[9] Gilbody J S,Wheeler M J,Wolstencroft R,et al.Dose-related effects of oestradiol on rat thymic and splenic t-lymphocyte responsiveness to mitogens [J].Int J Immunopharmacol,1992,14(2):167-172.

[11] Hofmann L R,Holznagel E,Lutz H.Female cats have lower rates of apoptosis in peripheral blood lymphocytes than male cats:Correlation with estradiol-17β,but not with progesterone blood levels [J].Vet Immunol Immunopathol,1998,65(2):151-160.

[12] Jenkins J K,Suwannaroj S,Elbourne K B,et al.17β-estradiol alters Jurkat lymphocyte cell cycling and induces apoptosis through suppression of Bcl-2 and cyclin A [J].Int Immunopharmacol,2001,1:1897-1911.

[13] Zajchowski S,Hoffman-Goetz L.Supraphysiological level of es-trogen exposureinvivoincreases lymphoid cell death in mice [J].Life Sciences,2000,66(15):1451-1459.

[14] Cheskis B J,Greger J G,Nagpal S,et al.Signaling by estrogens [J].J Cell Physiol,2007,213(3):610-617.

[15] Kim W U,Min S Y,Hwang S H,et al.Effect of oestrogen on T cell apoptosis in patients with systemic lupus erythematosus [J].Clin Exp Immunol,2010,161(3):453-458.

[17] Jankowski M,Bissonauth V,Gao L,et al.Anti-inflammatory effect of oxytocin in rat myocardial infarction [J].Basic Res Cardiol,2010,105(2):205-218.

[19] Ochedalski T,Subburaju S,Wynn P C,et al.Interaction between oestrogen and oxytocin on hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity [J].J Neuroendocrinol,2007,19(3):189-197.

[20] Insel T R,Young L,Witt D M,et al.Gonadal steroids have paradoxical effects on brain oxytocin receptors [J].Neuroendo,1993,5:619-628.

[21] Peter A B,Jaak P,Bluthé R M,et al.Acute effects of steroid hormones and neuropeptides on human social-emotional behavior:A review of single administration studies [J].Front Neuroendocrinol,2012,33:17-35.

[22] Brown S L,Fredrickson B L,Wirth M M,et al.Social closeness increases salivary progesterone in humans [J].Horm Behav,2009,56(1):108-111.

[23] Mccarthy M M,Macdonald C H,Brooks P J,et al.An anxiolytic action of oxytocin is enhanced by estrogen in the mouse [J].Physiol Behav,1996,60(5):1209-1215.

[24] Ebstein R P,Knafo A,Mankuta D,et al.The contributions of oxytocin and vasopressin pathway genes to human behavior [J].Horm Behav,2012,61(3):359-379.

[25] Mooney S J,Holmes M M.Social condition and oxytocin neuron number in the hypothalamus of naked mole-rats (Heterocephalusglaber) [J].Neuroscience,2013,230:56-61.

[26] Young L J.The neuroendocrinology of the social brain [J].Neuroendocrinology,2009,30(4):425-428.

[27] Ndiaye K,Poole D H,Pate J L.Expression and regulation of functional oxytocin receptors in bovine T lymphocytes [J].Biol Reprod,2008,78(4):786-793.

[28] Bos P A,Panksepp J,Bluthé R M,et al.Acute effects of steroid hormones and neuropeptides on human social-emotional behavior:A review of single administration studies [J].Front Neuroendocrinol,2012,33(1):17-35.

[29] Pournajafi N H,Carr M S,Papademeteriou E,et al.Oxytocin selectively increases ERα mRNA in the neonatal hypothalamus and hippocampus of female prairie voles [J].Neuropeptides,2007,41:39-44.

[30] Yamamoto Y,Carter C S,Cushing B S.Neonatal manipulation of oxytocin affects expression of estrogen receptor alpha [J].Neuroscience,2006,137(1):157-164.

Effects of oxytocin and estradiol benzoate on proliferation of peripheral blood lymphocytes of Small-tail Han sheepinvitro

XU Hou-ying1,ZHOU Bo1,LI Sheng-li2,YANG Li-jun1,LI Chuang-hong1,LI Xin-ping1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)

s： 【Objective】 This study investigated the effects of oxytocin (OXT) and estradiol (E2) on proliferation of peripheral blood lymphocytes and explored the interaction between OXT and E2.【Method】 The peripheral blood lymphocytes of female sheep at rest and stimulated by Concanavalin A (Con A) were treated by different concentrations of OXT and E2 (low concentrations of OXT 10 ng/mL and E2 50 pg/mL,medium concentrations of OXT 100 ng/mL and E2 500 pg/mL,and high concentrations of OXT 1 000 ng/mL and E2 5 000 pg/mL) and by different treatment methods (single use and combined use: simultaneous addition,E2 was 12 h after OXT,and OXT was 12 h after E2) before MTT assay was used to test the proliferation of lymphocytes and interaction of OXT and E2 was evaluated.【Result】 OXT had suppressive effect on both active and rested lymphocyte at low dose.E2 at low concentrations could promote the proliferation of T lymphocytes stimulated with Con A but had no effects on lymphocytes at rest.As the increase of concentration,E2 had suppressive effect on lymphocytes at different statuses.Thus,for the combination of OXT and E2 at low concentrations,the stimulation index (SI) of T lymphocytes stimulated with Con A was between the SI values of OXT or E2 alone.The lymphocytes at rest were significantly suppressed and the suppressive effect was stronger than OXT or E2 alone.Active lymphocytes treated with OXT and E2 at normal concentrations in succession had similar effects on proliferation of lymphocytes to adding hormone later.【Conclusion】 E2 at high concentration inhibited the proliferation of lymphocytes,whereas it promoted active lymphocytes at low concentration.OXT inhibited proliferation of lymphocytes.OXT and E2 at high concentration had synergy effect on lymphocytes at rest.OXT and E2 at low concentration had antagonism and altruistic effects on lymphocytes stimulated by Con A.

oxytocin;estradiol benzoate;peripheral blood lymphocyte;MTT assay;Small-tail Han sheep

2013-12-08

西北农林科技大学人才引进基金项目

徐厚英(1985-)，女，山东日照人，在读硕士，主要从事营养及生长生理研究。E-mail:vicky880306@163.com

李新平(1967-)，男，湖北谷城人，教授，博士生导师，主要从事动物营养及生长生理、兽药新剂型的研究。 E-mail: lxp67cqu@163.com

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.021

S859.79+3;S857.2+1

A

1671-9387(2015)05-0027-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.021.html