小鼠H1foo逆转录病毒载体的构建及表达

许 荣，张春林，宁 静，李 建，雷安民

(1 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100;2 第四军医大学 西京医院老年病科，陕西 西安 710032)

小鼠H1foo逆转录病毒载体的构建及表达

许 荣1,2，张春林1，宁 静1，李 建1，雷安民1

(1 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100;2 第四军医大学 西京医院老年病科，陕西 西安 710032)

【目的】 构建小鼠pMX-H1foo逆转录病毒载体,并使其在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中异位表达，为进一步研究H1foo在重编程方面的作用奠定理论基础。【方法】 根据NCBI公布的小鼠H1foo基因的mRNA序列设计引物，以小鼠卵巢组织总RNA为模板，RT-PCR扩增小鼠H1fooCDS序列，并连接到逆转录病毒载体pMX上。经双酶切鉴定和测序比对正确后，利用磷酸钙转染包装细胞plat-E的方法制备H1foo病毒液并感染MEF细胞,进一步收集感染的细胞进行半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测，分析其在细胞中的表达情况。【结果】 克隆得到915 bp的H1foo基因，构建得到逆转录病毒载体pMX-H1foo。该载体制备的病毒能够感染MEF细胞，并且H1foo在MEF细胞中与细胞核共定位，而对照组绿色荧光蛋白(GFP)遍布整个细胞。【结论】 成功构建了pMX-H1foo逆转录病毒载体，并在MEF中进行表达。

H1foo基因；逆转录病毒载体；多潜能性干细胞

卵母细胞特异性连接组蛋白 (oocyte-specific linker histone,H1foo)是组蛋白家族的成员之一，在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中特异性表达，对卵母细胞的发育、成熟、受精和早期胚胎的发育发挥着重要的作用。H1foo最早由Tanaka通过消减杂交的方法从小鼠中克隆得到，是卵中特异性表达的一种连接组蛋白，为单拷贝基因，定位于16号染色体上，开放阅读框长912 bp，可编码304个氨基酸，分子质量为34 ku。与体细胞型的连接组蛋白有类似的结构域，均由中间的球形域和两端的C、N端结构域组成，二者同源性低，但氨基酸和蛋白比对发现，H1foo与海胆卵母细胞表达的卵裂期组蛋白csH1[1]和爪蟾卵母细胞的连接组蛋白H1M(B4)[2]等非哺乳动物卵母细胞特异表达的连接组蛋白具有极高的同源性，均由N端、C端和中央的球状域构成，其中球状域具有种属及各连接组蛋白间的特异性[3-5]。

目前关于H1foo的研究很少，且大多数功能探索局限在成分复杂不明的卵母细胞中，这导致H1foo作用机制的研究工作面临众多可变因素，控制难度较大。近年来的研究发现，H1foo具有抑制ES细胞分化，参与细胞重编程的作用[6]。H1foo能够在体细胞的重编程中发挥作用，这就需要构建特异性的H1foo表达载体来揭示其作用机理。而诱导多能性干细胞技术是近年来受到广泛关注的一种体细胞重编程技术，最早由Yamanaka利用逆转录病毒载体pMX连接在4种转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)上，通过在体细胞中过表达这4种特定因子，实现体细胞到多能性细胞的重编程[7]。该技术使复杂的体内细胞重编程能够在体外实现，并受特定的4种因子的调控，这为研究特定因素对细胞重编程的影响机制提供了有力的支持。

小鼠是最主要的模式动物，本试验通过克隆小鼠的H1foo基因，构建逆转录病毒载体pMX-H1foo，验证其在体细胞中的表达定位，以期为H1foo的功能机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

昆白小鼠和129品系小鼠购自西安交通大学实验动物中心，逆转录病毒载体pMXs购自Addgene，大肠杆菌DH5α购自TIANGEN公司，Plat-E细胞系、pMX-GFP质粒为实验室保存。

1.2 主要试剂

限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、氨苄青霉素购自TaKaRa，PCR试剂、反转录试剂盒购自Fermentas公司，Trizol、琼脂糖购自Invitrogen公司，DNA纯化回收试剂盒、去内毒素质粒大提试剂盒、DNA Marker均购自TIANGEN公司，胎牛血清、新生牛血清、高糖DMEM培养基购自Hyclone公司，L-谷氨酰胺、非必需氨基酸购自Gibco公司，H1foo抗体购自Abcam公司，免疫荧光染色相关试剂购自碧云天公司，其他无特殊标注的所有化学试剂均购自Sigma公司。引物合成及DNA测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 鼠H1foo逆转录病毒载体的构建

1.3.1 鼠H1foo的克隆 根据GenBank中小鼠H1foo基因序列(GenBank登录号NM_138311.2)及逆转录病毒载体pMX的酶切图谱，用Primer 5.0软件设计H1foo特异性PCR扩增引物H1fooa，其序列见表1。

注：H1fooa中Forward和Reverse序列中下划线部分分别为BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点。

Note:The underline letters highlight digestion sites ofBamHⅠ andSalⅠ.

取小鼠卵巢组织，用Trizol法提取其总RNA，依据Fermantas公司的Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 说明书反转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，以H1fooa为引物进行PCR，扩增H1foo的编码区序列。PCR反应体系为： 10×TaqBuffer with (NH4)2SO42.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，上、下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，cDNA 4 μL，Taq酶0.25 μL，补水至25 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃终止反应。将PCR获得的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.2 鼠H1foo基因逆转录病毒载体的构建 将目的条带按照DNA回收纯化试剂盒说明书进行纯化后，进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切，酶切产物通过T4连接酶与经同样双酶切的逆转录病毒载体pMX于16 ℃连接过夜，构建逆转录病毒载体pMX-H1foo。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并均匀涂布在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜，挑取单个阳性菌落，37 ℃摇床振荡培养过夜。菌液PCR鉴定正确后用质粒小量提取试剂盒提取质粒进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，将鉴定正确的样品送检测序，测序鉴定正确后，进行高纯度质粒的大量提取。

1.4 逆转录病毒载体pMX-H1foo的表达

1.4.1 小鼠MEF (胚胎成纤维细胞)的分离与培养 将昆白母鼠与129品系公鼠合笼后每天检查阴道栓，待见栓13.5 d后，脱颈处死孕鼠，无菌操作取出胚胎，分离弃去胚胎的内脏、四肢及头部，期间清洗数次。剪碎组织，加入1.5 g/L胰蛋白酶(0.15 g胰蛋白酶溶于100 mL PBS中)消化后，继续剪2 min，再加约3NmL(N为胚胎数)的胰酶，置于培养箱于体积分数5% CO2中37 ℃孵育15 min，期间每隔4 min取出培养皿用巴氏吸管吹打1 min。终止消化后离心，重悬细胞沉淀，接种于培养皿中，体积分数5% CO2培养箱中37 ℃过夜培养，至细胞生长至90%融合并仍处于指数生长期时，冻存细胞。

1.4.2 H1foo转染包装细胞plat-E 转染前一天在100 mm的培养皿中接种约4×106mL-1的plat-E细胞，用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养1 d，在细胞生长至80%融合时换新鲜的培养液7.5 mL，1～2 h后利用磷酸钙转染法分别将鼠pMX-H1foo和pMX-GFP阳性对照质粒转染到plat-E细胞中，制备逆转录病毒液，以GFP作为评价病毒感染效率的对照。转染11～14 h后，小心换为新鲜培养液10 mL，在体积分数5% CO2的培养箱中37 ℃培养48 h。收取细胞培养上清液，0.45 μm滤器过滤病毒液，除去病毒液中的细胞碎片，并向plat-E培养皿中再加入10 mL新鲜培养基。

1.4.3 逆转录病毒感染MEF细胞 在六孔板中提前接种3孔MEF细胞，每孔5×104个细胞，感染前更换新鲜培养液。向收集的H1foo和GFP逆转录病毒液中分别加入polybrene，使其终质量浓度为8 μg/mL。混匀，用该病毒液感染MEF细胞，感染过夜后换为含体积分数20%胎牛血清和10 g/L非必需氨基酸的高糖DMEM培养基，以GFP作为评价病毒感染效率的对照，MEF未感染组作阴性对照。第2天进行病毒二次感染，步骤与第一次感染相同。

1.4.4 转染细胞的半定量PCR检测 根据小鼠H1foo基因序列，用Primer 5.0软件设计H1foo特异性PCR半定量检测引物H1foob，并以β-actin为内参(2个引物的序列见表1)，检测重组质粒的表达能力。

将逆转录病毒液感染的MEF细胞与未感染处理的MEF细胞培养48 h后，用Trizol法提取总RNA，经RT-PCR反转录为cDNA，反转录的体系和程序见Fermantas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 说明书。以反转录获得的cDNA为模板，H1foob为引物，进行目的片段的扩增。PCR反应体系为： 10×TaqBuffer with (NH4)2SO41.5 μL， 25 mmol/L MgCl21.6 μL，上、下游引物各0.3 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL，cDNA 1 μL，Taq酶 0.2 μL，补水至15 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃终止反应。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并用凝胶成像系统观察照相。试验以β-actin为内参基因，同时以pMX-H1foo质粒为阳性对照。

1.4.5 免疫荧光检测 分别处理逆转录病毒感染的MEF，检测H1foo在蛋白水平的表达。用体积分数4%的多聚甲醛固定逆转录病毒感染48 h后的MEF细胞，用PBS清洗3次，每次5 min；用体积分数0.1% Triton X-100通透处理10 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入体积分数1%的牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min；加入一抗H1foo(用封闭液稀释,使其为体积比1∶400)4 ℃过夜孵育，PBS清洗3次；加入荧光二抗，室温避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min；加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)处理2 min进行细胞核染色，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察照相。

2 结果与分析

2.1 H1foo基因的PCR扩增

以小鼠卵巢组织总RNA为模板，经过RT-PCR扩增得到915 bp的单一条带(图1)，与NCBI公布的小鼠H1fooCDS序列长度相符。

2.2 逆转录病毒载体pMX-H1foo的鉴定

图2表明，重组的逆转录病毒载体pMX-H1foo经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，获得了5 200 bp左右的载体骨架和915 bp的片段，与预期结果一致。经Blast比对，测序结果与NCBI公布的小鼠H1foo基因序列的相似性达100%。

图1 鼠卵巢组织中H1foo的克隆
M1.DNA Marker DL5000；A.逆转录病毒载体pMX的BamHⅠ和SalⅠ双酶切产物；B,C.卵巢组织； M2.DNA Marker DL2000
Fig.1 Cloning ofH1foofrom mouse ovary
M1.DNA Marker DL5000;A.Enzyme digestion of retroviral vector;B,C.Ovary tissue;M2.DNA Marker DL2000

图2 pMX-H1foo的酶切鉴定A～D.pMX-H1foo的BamHⅠ和SalⅠ双酶切产物；
M1.DNA Marker DL5000；M2.DNA Marker DL2000
Fig.2 Enzyme digestion of pMX-H1foo A-D.Products of digestion byBamHⅠ andSalⅠ;
M1.DNA Marker DL5000；M2.DNA Marker DL2000

2.3 病毒液的制备

分别利用Plat-E细胞包装pMX-H1foo和pMX-GFP病毒液，由于pMX-H1foo无荧光标记，故以GFP作为评价病毒感染效率的对照。48 h后荧光显微镜下观察GFP感染组，以明场作为空白对照，由图3可见，病毒液的转染效率大约为99%。

图3 Plat-E细胞感染pMX-GFP逆转录病毒48 h后感染效率的观察(比例尺=100 μm)
A.感染GFP病毒液的MEF细胞；B.明场空白对照；C.A与B图像的叠加
Fig.3 Production of pMX-GFP in Plat-E 48 h after infection (Bar=100 μm)
A.MEF cells infected with GFP virus;B.phase;C.Merge of A and B

2.4 感染细胞的半定量PCR检测

病毒液感染MEF细胞48 h后收集细胞，提取总RNA，反转录为cDNA进行半定量PCR检测。结果显示，从感染H1foo逆转录病毒的MEF中扩增到731 bp的H1foo特异性检测片段，而转染GFP逆转录病毒和未作处理的MEF中均未扩增到相应条带(图4)，表明本试验成功构建了pMX-H1foo逆转录病毒载体。

2.5 病毒感染MEF细胞的免疫荧光检测

病毒感染MEF后进行免疫荧光检测，由图5可知，感染H1foo病毒液的MEF经H1foo抗体免疫荧光检测显示阳性的红色荧光，感染GFP的MEF及未作病毒感染处理的MEF经H1foo抗体检测均为阴性。

3 讨 论

核小体是组成染色体的基本结构单元，其由4种核心组蛋白组成的八聚体(H2A,H2B,H3和H4各1对)与环绕周围的DNA构成。在相邻的核小体之间，连接组蛋白H1以序列依赖性的方式绑定到DNA上，连接固定核小体，参与维持核小体结构的稳定[8-10]。连接组蛋白家族是组蛋白中成员最多的家族，在真核生物中主要有11种不同的亚型，其中只有H1foo是卵特异性表达的连接组蛋白[11]，也是与H1组蛋白家族其他成员的序列同源性较低的一个特殊H1成员[4]。

H1foo基因为单拷贝基因，定位于常染色体上， H1foo与其他非哺乳动物卵母细胞中特异表达的连接组蛋白，如海胆卵母细胞中的卵裂球组蛋白 (cleavage-stage histone1,csH1)和爪蟾卵母细胞中特异表达的组蛋白H1M(B4)有很高的同源性。检测发现，小鼠H1foo的mRNA在GV期卵母细胞到8细胞期胚胎均有表达，且随着胚胎发育的推进其表达量逐渐降低。蛋白水平上，GV期时H1foo的表达量最高，随后逐渐降低，在4细胞期时已检测不到H1foo的表达[11]。

图4 病毒感染MEF细胞的半定量PCR检测(β-actin为内参)
M.DNA Marker Trans Plus 2000；A.感染H1foo病毒的MEF细胞； B.感染GFP病毒的MEF细胞； C.未作处理的MEF细胞；P.pMX-H1foo质粒阳性对照；N.阴性对照
Fig.4 Semi-quantitative detection of infected MEF cells
(take β-actin as internal control)
M.Trans Plus 2000;A.MEF cell with H1foo virus;B.MEF cell with GFP virus;C.MEF;P.Positive;N.Negative control

图5 感染逆转录病毒H1foo和GFP的MEF细胞的免疫荧光检测
A.感染H1foo逆转录病毒的MEF细胞；B.未感染逆转录病毒的MEF细胞；C.感染GFP逆转录病毒的MEF细胞；1.GFP荧光观察； 2.H1foo抗体检测；3.DAPI验证细胞核； 4.图片1，2，3的叠加；比例尺=100 μm
Fig.5 Immunofluorescence of MEF cells infected by H1foo or GFP
A.MEF cells infected with H1foo virus;B.Uninfected MEF cells;C.MEF cells with GFP virus;2.Anti-H1foo detection;3.DAPI;4.Merge of 1,2,3;Bar=100 μm

小鼠H1foo基因定位于卵母细胞的细胞核，本研究将pMX-H1foo重组逆转录病毒载体和pMX-GFP分别经plat-E细胞包装病毒，感染小鼠MEF细胞，免疫荧光检测发现H1foo与细胞核共定位，而GFP分散于整个细胞中，与之前的研究结果一致[3，12]。

H1foo参与体细胞的重编程过程。在小鼠、牛、猪等体外受精和核移植过程中均存在H1foo与其他成分的置换。在体外受精中发生的是卵中H1foo与精子内鱼精蛋白的置换[13-14]，核移植过程中则出现H1foo与体细胞型连接组蛋白的快速置换现象[15-17]，并且H1foo比被置换的成分具有更高的流动性，这种置换有利于供核体细胞染色质构象的打开，实现基因组的完全重编程，恢复全能性[13]。凝集的染色体被认为是核重编程的一大障碍，不利于特定的转录因子结合到紧密包裹起来的DNA位点上[18]。因此，高流动性的染色体结构及染色体的解凝作用对提高重编程的效率有一定的作用。另有研究也发现，爪蟾属GV期卵母细胞中的B4促进了已分化体细胞的重编程[19]。ES细胞中异位表达H1foo后，会抑制细胞的分化，使细胞持续表达多潜能标记基因Nanog、Myc和Klf9[6]，但其在诱导多能性干细胞(iPSCs)中的作用仍未见报道。

诱导多能性干细胞最早由Yamanaka等[7]利用逆转录病毒载体pMX连接在4种转录因子上，通过在体细胞中过表达这4种因子，实现体细胞到多能性细胞的重编程，但低效率及致癌性是其不容忽视的问题。然而，至今仍无相关研究指明是否是H1foo或其同源物B4在iPSCs细胞的产生过程中发挥着重要作用。目前，本实验小组已购买得到了商品化的Yamanaka 4因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)，并建立了稳定的小鼠iPSCs诱导体系，本研究中所构建的pMX-H1foo逆转录病毒载体，为进一步研究小鼠H1foo在诱导多能性干细胞这一重编程过程中的作用奠定了基础。

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Construction and expression of retroviral vector pMX-H1foo in mouse embryonic fibroblast

XU Rong1,2,ZHANG Chun-lin1,NING Jing1,LI Jian1,LEI An-min1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2DepartmentofGeriatrics,XijingHospital,ForthMilitargMedicalUniversityXi’an,Shaanxi710032,China)

【Objection】 This study constructed and expressed recombinant retroviral plasmid pMX-H1foo in mouse embryonic fibroblast (MEF) cells to further investigate the function of H1foo in the induced pluripotent stem cell.【Method】 Primers ofH1foowere designed according to the published mRNA sequence of mouse oocyte-specific linker histone (H1foo:NM_138311.2) in NCBI database.The CDS ofH1foowas amplified from RNA of mouse ovary using RT-PCR and then cloned into the retroviral vector pMX.The recombinant retroviral plasmid was named as pMX-H1foo after being confirmed byBamHⅠ andSalⅠ double digestion and DNA sequencing.Then it was packaged in plat-E cells using the method of calcium phosphate transfection,and MEF was infected by the obtained virus after collecting viral supernatant.The expression of pMX-H1foo was identified by RT-PCR and immunofluorescence.【Result】 TheH1foogene was amplified and the recombinant retroviral plasmid pMX-H1foo was constructed successfully and infected into MEF cells.Semi-quantitative RT-PCR and immunofluorescence staining proved that H1foo was expressed in the nuclei of MEF cells while GFP was located everywhere in MEF cells.【Conclusion】 The construction and expression of recombinant retroviral plasmid pMX-H1foo in MEF cells was successful in this study.

H1foogene;retroviral vector;induced pluripotent stem cell

2013-12-10

国家自然科学基金项目(31172280)

许 荣(1986-)，女，陕西西安人，在读硕士，主要从事生物技术研究。E-mail:xurong1988416@nwsuaf.edu.cn

雷安民(1970-)，男，河南灵宝人，副教授，博士，博士生导师，主要从事生物技术研究。 E-mail:anminleiryan@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.020

Q78

A

1671-9387(2015)05-0021-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.020.html