副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

高 艳，张定全，杨增岐，梁留存，刘海金，吴朋朋，高小龙，常旭东，杜恩岐

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌712100)

副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

高 艳，张定全，杨增岐，梁留存，刘海金，吴朋朋，高小龙，常旭东，杜恩岐

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌712100)

【目的】 建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法，以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】 利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制备血清抗体，建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法，对制备抗原的优势菌株进行筛选，并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】 选出Ew株作为制备抗原的种子菌株，成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法；该方法具有良好的特异性和敏感性，抗原最适工作浓度为8×109CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与临床诊断结果基本一致。【结论】 建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法能够对副猪嗜血杆菌病做出较为快速、准确的诊断；陕西省存在副猪嗜血杆菌不同程度的感染，规模猪场集中饲养的猪感染副猪嗜血杆菌的比率明显高于散户。

副猪嗜血杆菌；抗原制备；平板凝集；抗体检测

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)通常寄生于猪的上呼吸道，一般情况下不发病[1]，但在猪群存在其他病原感染以及环境变化等因素的影响下，能够引发以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、支气管肺炎等为特征的严重全身性疾病[2]。临床上，猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、沙门菌等可引起与副猪嗜血杆菌病相似的症状，且往往与这些菌混合感染猪，所以应特别注意副猪嗜血杆菌病与这些病的鉴别诊断[3-4]。检测副猪嗜血杆菌病的方法有很多种，如间接血凝抑制试验法、平板凝集试验法、琼脂扩散试验法、ELISA等[5]。但目前国内采用平板凝集试验法来检测副猪嗜血杆菌的详细文献报道较少。本试验在制备副猪嗜血杆菌平板凝集抗原的基础上，初步建立了副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法，并用此方法对陕西部分地区猪场的猪进行了副猪嗜血杆菌血清抗体检测，证明本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法具有简便、快速、经济、准确等优点，可用于集约化猪场和散养猪副猪嗜血杆菌病的检疫及流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 材 料

9株副猪嗜血杆菌(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2株)，由西北农林科技大学动物医学院传染病实验室从陕西省关中地区患多发性浆膜炎和关节炎猪场中分离鉴定和保存。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌阳性血清、猪链球菌阳性血清、副猪嗜血杆菌标准阳性血清，均由西北农林科技大学动物医学院传染病实验室提供；其他血清是2012-2013年期间，采集自陕西部分猪场和散养户。1.5 kg/只左右的健康家兔，购自西北农林科技大学实验动物中心。

1.2 方 法

1.2.1 副猪嗜血杆菌的复苏与扩大培养 从冰箱中取出冻存的副猪嗜血杆菌菌液，在38 ℃左右水浴中快速使其复苏，将复苏菌液移至TSA固体培养基上，37 ℃培养24～36 h，观察菌落形态并进行鉴定。

[6-8]中的方法并加以改进，将复苏鉴定好的菌株移至TSA固体培养基上进行培养，连续传2～3代复壮后制备抗原。

1.2.2 免疫阳性血清与阴性血清的制备 用制备好的副猪嗜血杆菌抗原与氢氧化铝佐剂按照体积比1∶1混合，背部皮下多点注射免疫健康家兔，每个点注射500 μL，共免疫3次，每次8×109CFU/mL。一免以后间隔7 d进行二免，二免后间隔7 d进行三免，三免后7 d无菌心脏采血，分离血清，小量分装，置-20 ℃保存备用。采集无副猪嗜血杆菌感染的健康家兔血清，作为阴性血清，置-20 ℃保存备用。

1.2.3 副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立 按照平板凝集试验方法[8]，取1块洁净的玻璃板，垂直滴加制备好的抗原和血清各50 μL，用火柴棒充分混匀，室温放置3～5 min，观察结果。同时，用生理盐水设立对照。

1.2.4 可靠性试验 以9株副猪嗜血杆菌为抗原，用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法，检测134份猪副猪嗜血杆菌标准阳性血清和50份标准阴性血清，记录结果。

1.2.5 优势抗原菌株的筛选 以9株副猪嗜血杆菌为抗原，用本试验建立的平板凝集试验方法检测276份血清，根据抗原与检测血清出现凝集反应程度的不同，筛选出制备抗原的最佳菌株。试验检测的276份血清中142份是2012-2013年期间采集自陕西省的一些发病猪场(神木某猪场95份、扶风某猪场32份、宝鸡某猪场15份)，另外134份阳性血清由传染病实验室采集并检测。

1.2.6 抗原最佳工作浓度的确定 用0.5%的无菌石炭酸生理盐水调整副猪嗜血杆菌抗原为1×1010，9×109，8×109，7×109，6×109，5×109，4×109和3×109CFU/mL 8个梯度，用此8个梯度的副猪嗜血杆菌抗原测定免疫兔血清中副猪嗜血杆菌抗体，以确定抗原的最佳工作浓度。

1.2.7 特异性试验 以Ew株副猪嗜血杆菌为抗原，用本试验建立的平板凝集试验方法检测制备好的兔副猪嗜血杆菌免疫阳性血清30份、兔阴性血清30份、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌阳性血清30份、猪链球菌阳性血清30份，同时用生理盐水设立对照。

1.2.8 副猪嗜血杆菌平板凝集试验对临床样品的检测 试验检测的血清是2012-2013年期间，采集自陕西省的一些猪场和散养户，共282份，其中扶风某猪场32份、宝鸡某猪场15份、勉县某猪场14份、华县某猪场18份、神木县某商品猪场95份、神木某种猪场(1)20份、神木县某种猪场(2)38份、神木县散养户猪场50份。所有采血猪均未进行副猪嗜血杆菌病疫苗免疫。用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法检测采集血清样，并结合临床诊断结果判断副猪嗜血杆菌病的流行情况。

2 结果与分析

2.1 副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法的可靠性

9株副猪嗜血杆菌抗原与阳性血清凝集反应率达96.3%～100.0%(表1)，与阴性血清的凝集反应率为0。说明本试验制备的副猪嗜血杆菌抗原及建立的平板凝集试验方法可靠，且具有很强的实用性。

2.2 制备副猪嗜血抗原优势菌株的筛选

由表2可以看出，本试验制备的副猪嗜血杆菌抗体基本可检测出陕西地区副猪嗜血杆菌流行株；Ew株较其他菌株抗原与阳性血清反应的凝集程度强，其次为Ea株，其他菌株反应凝集情况基本相同。表明Ew菌株具有较强的凝集反应性，可作为今后制备副猪嗜血杆菌抗体和弱毒苗的备选菌株。

2.3 副猪嗜血杆菌抗原最佳工作浓度的确定

平板凝集试验结果(表3)表明，兔副猪嗜血杆菌阳性血清4倍稀释，抗原浓度为8×109CFU/mL时，抗原与血清凝集现象最明显，液体完全透明，凝集颗粒物大如沙粒，因而确定抗原的最适工作浓度为8×109CFU/mL。

注：“++++”.液体完全透明，凝集颗粒物如大沙粒；“+++”.出现较多的凝集颗粒物,液体几乎完全透明，即75%凝集；“++”.有沙粒状凝集颗粒物，液体不完全透明，即50%凝集；“+”.液体混浊，有较少的小的颗粒状物，即25%凝集;“-”.液体均匀混浊，无凝集物。

Note:“++++”.Liquid is completely transparent,aggregation of particles such as large sand;“+++”.Appearing more aggregated particles,liquid is completely transparent with 75% agglutination;“++”.Agglutination particles such as sand granular,the liquid is not completely transparent with 50% agglutination;“+”.Liquid is turbid, there are fewer small pellets with 25% agglutination;“-”.Liquid is evenly turbid,no aggregate.

2.4 副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法的特异性

特异性试验结果表明，兔阴性血清对照组、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌阳性血清和猪链球菌阳性血清无凝集现象；兔副猪嗜血杆菌阳性血清试验组100%凝集，说明副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法具有良好的特异性。

2.5 副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床样品的检测

对7个猪场和神木县部分散养户的282份血清样进行检测，结果见表4。结合表4结果及发病情况可知：(1) 检测出为阳性血清的猪，临床表现为被毛粗乱、消瘦、体温升高、关节肿胀、呼吸困难；剖检可观察到胸腔内纤维素性渗出严重，肺与胸腔壁黏连，胸腹腔积液较多，出现典型的绒毛心，脾脏梗死，肝脏有大量的出血斑等典型的副猪嗜血杆菌临床症状。检测结果与病猪剖检结果相符，表明试验结果可靠。进一步证明，建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法具有较强的临床实用性。

(2)供检猪场均有副猪嗜血杆菌检出，其中关中3个猪场(扶风某猪场、宝鸡某猪场和华县某猪场)平均阳性检出率为81.5%，陕南1个猪场(勉县某猪场)阳性检出率为64.3%，陕北神木县3个猪场的平均阳性率达到60.1%。表明陕西已有副猪嗜血杆菌病流行，且流行覆盖面较广。

(3)发病季节多集中在秋冬、冬春冷热交替的季节，说明副猪嗜血杆菌病在秋冬、冬春冷热交替的季节较其他时间更容易发生。另外，检测血清多为31～70日龄保育舍发病猪，表明4～10周龄猪更容易感染此病。

(4)神木县散养户猪场的50份血清中阳性血清3份，阳性率为6.0%；3个猪场的153份血清，检出副猪嗜血杆菌阳性血清92份，阳性检出率为60.1%。此结果表明，副猪嗜血杆菌病在散养户猪场的发病率明显低于集约化猪场。因此，要求集中饲养的猪场在管理与疫病防控方面更要重视，以避免副猪嗜血杆菌的规模集中感染。

3 讨 论

检测副猪嗜血杆菌的方法很多，如用灭活的副猪嗜血杆菌菌体作为包被抗原的ELISA法、补体结合试验以及多聚酶链式反应(PCR)法等[9-10]，另外，林雪玲等[11]还建立了副猪嗜血杆菌的快速聚合酶链式反应诊断技术，可对该病作出迅速的诊断。这些方法具有较强特异性和较高敏感性，但检测成本较高。本试验采用平板凝集试验法检测副猪嗜血杆菌血清抗体，虽然与上述几种方法相比，特异性和敏感性稍差，但操作简便快捷、易掌握、成本低，可对该病作出快速的诊断。本试验所用菌株是由西北农林科技大学动物医学院传染病实验室从陕西关中地区猪场中分离得到，是陕西地区流行的菌株。本试验制备的抗原可检测出陕西地区副猪嗜血杆菌阳性血清，可用于区别感染猪与非感染猪，也可用于陕西地区猪场副猪嗜血杆菌临床快速诊断和流行病学调查。

通过对陕西地区一些猪场及散养户猪的血清抗体检测，了解和掌握了陕西地区副猪嗜血杆菌病的流行情况，对陕西地区该病的预防和控制有一定的指导价值。本研究结果显示，副猪嗜血杆菌病已成为陕西地区普遍流行的疾病，应提高警惕，加强防治管理。此外，规模猪场集中饲养的猪感染Hps的比率明显高于散户，说明集中饲养更容易造成猪的成批感染[12]；另外，从采样猪发病的时间可以看出，该病在秋冬、冬春等冷热交替的季节更容易发生。因此，气候变化时，猪场更应该注意加强饲养管理[13]。猪场可利用“二点三点法”饲喂，即将猪场分散在不同的地点，按照猪成长阶段分批分群饲养在不同的地点，以避免疫病的交叉感染[14]。具体操作方法为:哺乳仔猪在21 d前断乳，然后将其转移饲养到另外一个生产区，并对该生产区彻底消毒，保持猪舍干净清洁，以减少病原微生物，使仔猪处于较好的环境中生长发育，而且此时仔猪体内的特殊疾病免疫抗体还没有完全消失，具有较好的抵抗力[15]。

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Establishment and application of plate agglutination method for detecting antibody againstHaemophilusparasuis

GAO Yan,ZHANG Ding-quan,YANG Zeng-qi,LIANG Liu-cun,LIU Hai-jin,WU Peng-peng,GAO Xiao-long,CHANG Xu-dong,DU En-qi

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to establish a rapid method for detecting antibody of Hps and prepare the plate agglutination antigen for the detection of serum Hps antibody. 【Method】 9 Hps strains (Ea,Ec,Ew,A1,A2,B1,B2,C1,and C2) stored in the infectious disease lab were revived and serum antibodies of immunizing rabbits was prepared.Then the plate agglutination method for detecting serum Hps antibody was established and the specificity,sensitivity,and best working concentration were decided.【Result】 Ew strain was selected as the strain for generating antigen.The plate agglutination method for detecting antibody againstHaemophilusparasuiswas successfully established.The method had good specificity and sensitivity,and the suitable working concentration of antigen was 8×109CFU/mL.The test results of clinical serum samples with the clinical diagnosis were basically the same.【Conclusion】 The established plate agglutination method of Hps measurement diagnosed Glässer’s disease more rapidly and accurately.The results also showed that the Hps infection rate of scale pig farm was higher than that of scattered farms in Shaanxi.

Haemophilusparasuis;antigen preparation;agglutination;antibody detection

2013-09-13

陕西省农业科技创新项目(2011NXC01-10)

高 艳(1986-)，女，陕西榆林人，在读硕士，主要从事动物传染病的诊断与防制研究。E-mail：616291725@qq.com

杨增岐(1963-)，男，陕西岐山人，教授，博士，博士生导师，主要从事动物疫病诊断与防制研究。 E-mail:yzq1106@nwsuaf.edu.cn

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.028

S853.31

A

1671-9387(2015)01-0021-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.028.html