巨噬细胞与脊髓损伤的研究进展

谢侃综述，冯大雄审核

（1四川医科大学研究生院，2四川医科大学附属第一医院脊柱外科，四川泸州646000）

巨噬细胞与脊髓损伤的研究进展

谢侃1综述，冯大雄2审核

（1四川医科大学研究生院，2四川医科大学附属第一医院脊柱外科，四川泸州646000）

脊髓损伤后，减轻继发性损伤、补充丢失神经元、促进损伤轴突的再生已成为脊髓损伤的研究热点。脊髓损伤后，损伤区多种细胞、多系统、多机制参与炎症、免疫、化学反应[1-3]导致外周血源性巨噬细胞和脊髓损伤处小胶质细胞的激活、积聚、吞噬坏死组织碎片、分泌炎性细胞因子、生长及神经营养因子导致脊髓损伤加重，同时也促进髓鞘及轴突再生[4-6]。据最近研究表明，这种截然不同作用，与巨噬细胞不同极化方向有关[7]。国内外许多研究者从脊髓损伤后巨噬细胞的应答、脊髓损伤区微环境与其极化方向的关系、不同细胞表型的巨噬细胞功能，寻求调控巨噬细胞极化方向促进轴突再生的方法。本文就巨噬细胞与脊髓损伤的研究进展进行综述。

1 巨噬细胞/小胶质细胞

巨噬细胞是机体重要免疫细胞，其属于单核巨噬细胞系统，具有吞噬、抗原提呈及分泌多种细胞因子等作用。在传统观点认为，在骨髓中，在细胞因子IL-1、IL-3和(或)IL-6诱导干细胞分裂成粒细胞-红细胞-巨核细胞-巨噬细胞集落形成单元，并在IL-1和(或)IL-3存在下分化形成粒细胞和巨噬细胞前体，并在集落刺激因子(CSF)、粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)等刺激下分形成单核细胞[8]。单核细胞进入外周血液，一方面分化形成巨噬细胞，同时也可随血流到中枢神经系统，产生形态学变化，形成小胶质细胞[9]。但不是全部小胶质细胞均来源于单核细胞。据最近研究表明，一些小胶质细胞在胚胎8 d前由卵黄囊中产生的髓系前体细胞分化而来[10]。同样，据最近研究表明，成人各组织中大多数巨噬细胞在胚胎发育时即开始出现，少部分则是由血液循环中的单核细胞分化而来[11]。

小胶质细胞在中枢神经系统中，有着不同形态，可有分枝状和阿米巴状，不同形态代表不同的功能状态：前者代表静息的小胶质细胞，后者代表激活的小胶质细胞。小胶质细胞平时处于静止状态,当中枢神经系统损伤或炎症时，它迅速被激活，并从分枝状将细胞上突起收回转变成阿米巴形吞噬细胞形态。据研究表明，激活的小胶质细胞和外周血源性巨噬细胞在形态学（都呈阿米巴型吞噬细胞形态）和免疫标记物（CD11b、CD45、GR1）上是不能区别的，故这两种细胞都统称为巨噬细胞[4]。

在脊髓损伤后，激活了多种炎细胞，同时也在脊髓损伤中发挥了重要作用。Popovich等[12]通过光镜及电镜下观察OX42（即CD11b）标记的巨噬细胞、OX19标记的T淋巴细胞及GFAP标记的星形细胞，发现在脊髓损伤中心的小胶质细胞于损伤后第3 d和第7 d达到高峰，并于2至4周后在巨噬细胞浸润至脊髓头侧及尾侧达到稳定数量，T淋巴细胞于损伤后3至7 d达到高峰，而星形胶质细胞于7至28 d达到高峰，巨噬细胞占主要数量分布于受损部位，而T淋巴细胞和反应性星形胶质细胞只是散在其周围。同时Sroga等[13]实验表明，在大鼠脊髓损伤3 d后，即可在损伤脊髓处与周边白质交界区测到用OX42标记的巨噬细胞，7 d时巨噬细胞达到高峰并可持续存在28 d，28 d后OX42标记的巨噬细胞开始减少。以上说明，在脊髓损伤时，巨噬细胞/小胶质细胞参与其炎症反应，且数量最多、持续最久，并起到重要作用。

2 巨噬细胞/小胶质细胞对脊髓继发性损伤的作用

2.1 巨噬细胞/小胶质细胞对脊髓损伤的识别

巨噬细胞是一种高度动态性的细胞，它可快速识别一种来自于病原体的蛋白序列即病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPS)和来自于损伤细胞的蛋白序列即损伤相关分子模式(Damage associated molecular pattern molecules，DAMPS)。PAMPS和DAMPS被巨噬细胞表面的Toll样受体(TLRs)、NOD样受体（NLRs）等所识别[14]。而这种配体、受体的结合，激活了巨噬细胞在脊髓感染及损伤时的炎症反应，而这种炎症反起到双刃剑作用，既有不利方面，也有有利方面。

2.2 不利方面

Popovich等[15]通过在脊髓损伤老鼠炎症最强期间，用脂质体包裹的氯膦酸盐来耗尽外周血源性巨噬细胞，其发现脊髓损伤老鼠的下肢运动得到了明显恢复，并发现该方法很大程度保留了有髓鞘的轴突、减少了脊髓的空穴现象、增强了损伤部位轴突的再生，提示了巨噬细胞对脊髓损伤具有不利作用。

在脊髓损伤时，被激活的巨噬细胞第一时间释放出多种促炎症细胞因子、蛋白酶及其他细胞毒性因子，这些细胞细胞因子能促进巨噬细胞/小胶质细胞在损伤部位的聚集[4]。Pineau等[16]通过检测小鼠在脊髓损伤后释放的细胞因子的mRNA表明，在脊髓损伤后，巨噬细胞可产生IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6、白血病抑制因子(LIF)。Boato F等[17]通过腹腔内注射IL-1β于脊髓损伤小鼠，发现其脊髓损伤症状加重，而缺乏IL-1β的脊髓损伤小鼠起脊髓损伤症状得到恢复。Ferguson，Pickering等[18-19]发现，谷氨酸作为神经系统中主要的兴奋性神经递质，需通过谷氨酸受体(AMPAR)来接受从神经细胞内通过突触前膜释放的谷氨酸转运至突触后膜来维持神经细胞兴奋性，而脊髓损伤时巨噬细胞释放的大量TNF-α可降低突触功能、损伤AMPAR，从而导致神经细胞死亡。Lacroix等[20]通过注射高浓度IL-6于脊髓损伤大鼠中，发现脊髓损伤部位与为注射IL-6脊髓损伤大鼠相比，白细胞数量增加了6倍、巨噬细胞/小胶质细胞浸润增加了2倍、但轴突生长数量却少了4倍。Kerr等[21]则通过腺病毒载体过度表达LIF于成年小鼠脊髓中发现，其出现严重下肢运动功能障碍。以上则说明了巨噬细胞可通过产生细胞因子如IL-1β、TNF、IL-6、LIF导致脊髓损伤加重，其对于脊髓损伤有不利作用。

2.3 有利方面

为了证明巨噬细胞对损伤脊髓的有利作用，Prewitt等[22]通过分别用浸润巨噬细胞、转化生长因子-β(TGF-β)、巨噬细胞抑制因子(MIF)的硝化纤维移植于损伤脊髓组织，并将脊髓背根神经节贴于损伤组织上，观察背根神经节轴突再生，发现浸润巨噬细胞及TGF-β组背根神经出现轴突再生，而浸润MIF组背根神经轴突几乎无再生，而Kiefer等[23]同时研究表明，在横切面部神经后，巨噬细胞可产生TGF-β。故说明巨噬细胞及TGF-β可促进损伤脊髓的再生。

据研究表明，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是一种在脑中、神经元及神经胶质中表达的造血细胞因子，其可以促进小胶质细胞的生成，同时也具有保护神经保护功能[24]，而Mitrasinovic等[25]研究发现巨噬细胞可通过过度表达巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR),与M-CSF共同发挥神经保护作用。而另有研究表明，巨噬细胞可通过吞噬髓鞘碎片[26]和分泌生长及神经营养因子(BDNF)来促进髓鞘再生[27]通过腺病毒相关病毒(AAV)携带神经营养因子形成AAV-BDNF于脊髓损伤大鼠中，发现大鼠的踏步运动得到增强，则说明巨噬细胞可通过分泌BDNF来促进脊髓损伤的恢复。

3 脊髓损伤与巨噬细胞的极化

3.1 巨噬细胞/小胶质细胞的极化与表型

巨噬细胞对于脊髓损伤加重损伤及修复损伤的两种截然不同的作用则是与其极化方向的不同有关。巨噬细胞的极化是指巨噬细胞在不同微环境下如存在IFN-γ、INF、IL-10、IL-13等细胞因子下，可极化产生两种不同表型，即M1型即经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)及M2型即替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage)[29]。M1型巨噬细胞是指巨噬细胞在Th1细胞因子如IFN-γ诱导下极化形成的一种表型，其特征性表型标记为：CD16、CD32、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)[12]，其能增强巨噬细胞杀菌作用，同时也能导致脊髓损伤加重。M2型巨噬细胞是指巨噬细胞在Th2细胞因子如IL-4、IL-13等诱导下极化形成的一种表型，其特征性表型标记为：精氨酸酶1(Arg1)、CD163、CD204、CD206、YN1、 Fizz1[12]其能减少、修复与保护机体于炎症反应，促进损伤组织的修复与再生。

3.2M1型巨噬细胞的极化及功能

当脊髓损伤时，巨噬细胞则是作为第一刻反应的细胞，能由自身许多免疫受体如Toll样受体(TLRs)、NOD样受体（NLRs）、和各种清道夫受体[14]能识别PAMPS和DAMPS并表达产生细胞细胞因子如：TNFα、IL-1β、IL-6、IFN-γ及许多趋化因子如：CCL8、CCL15、CXCL9等[30]，这些细胞因子及趋化因子能促进巨噬细胞极化形成M1型巨噬细胞，并增加巨噬细胞吞噬及抗原提呈能力。由Th1细胞、小胶质细胞和星形细胞产生的IFN-γ[31-33]对于极化巨噬细胞为M1型巨噬细胞也同样起到重要作用。这同时也说明，巨噬细胞既能通过自分泌又能旁分泌的方式来控制自身的极化。

为了研究M1型巨噬细胞的功能，Horn等[34]通过IFN-γ和脂多糖(LPS)共同极化巨噬细胞为M1型巨噬细胞，将其直接作用于大鼠的损伤脊髓处的营养不良的轴突，发现M1型巨噬细胞能很好的与营养不良的轴突接触，并导致轴突的回缩。据研究表明，M1型巨噬细胞能产生细胞因子（如:TNFα、IL-6等）、活性氧、蛋白水解酶、一氧化氮等，都能直接损害神经元及神经胶质[35]。故M1型巨噬细胞虽能释放促炎症细胞因子增强巨噬细胞吞噬作用并清除坏死细胞[36]，但这种持续、无序的炎症反应同样能加重脊髓损伤。

3.3M2型巨噬细胞的极化及功能

M2型巨噬细胞产生的一系列细胞因子、趋化因子来识别。据研究表明，可由Th2细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞本身产生的细胞因子如IL-4、IL-13、GM-CSF等可极化巨噬细胞为M2型巨噬细胞[37]。

据研究M2型巨噬细胞通过表达一系列物质作为特征性表型标记来识别,其中精氨酸酶1(Arg1)则是重要的一个特征性表型标记，其表达的Arg1则将精氨酸转换为鸟氨酸、脯氨酸及多胺类等，以上可促进伤口愈合及基质沉积[38]。同样的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)则可作为M1型巨噬细胞的特征性表型标记，其可产生一氧化氮导致组织损伤[34]。当iNOS作用于精氨酸时，Arg1与精氨酸的作用明显超过iNOS的作用，并能抑制iNOS产生一氧化氮导致组织损伤的反应[39]，故Arg1能作为M2型巨噬细胞的特征性表型标记，并说明M2型巨噬细胞具有组织修复功能。

M2型巨噬细胞可根据不同的可极化巨噬细胞的细胞因子而分为3个亚型，包括：M2a、M2b、M2c型巨噬细胞[40]。其中，M2a型巨噬细胞可由IL-4、IL-13极化巨噬细胞而形成，而M2c型巨噬细胞则可有IL-10及TGF-β极化而来，它们两种亚型具有抗炎症反应及修复损伤功能，而M2c型巨噬细胞则最不同于M2型巨噬细胞而和M1型巨噬细胞相似，它缺乏典型M2型巨噬细胞特征性表型标记如Arg1、YM1和Fizz1，而具有M1型巨噬细胞特征性表型标记如MCHII和CD86，但它功能却更倾向于M2型巨噬细胞，能产生大量抗炎症细胞因子IL-10及少了促炎症细胞因子IL-12,但它同时也产生了TNFα、IL-1β和IL-6这些能导致组织损伤的细胞因子[12]，也就说明M2b型巨噬细胞具有复杂的机制去调控炎症反应，而不是局限于损伤或是修复。

为了研究M2型巨噬细胞对损伤脊髓的作用，Kigerl等[6]发现在损伤脊髓处，M2型巨噬细胞基因表达非常短暂，到第7 d后则回到脊髓未损伤水平，而M1型巨噬细胞基因表达可至少持续1个月，再用荧光染色来自骨髓的M2型巨噬细胞移植于损伤脊髓，3～7 d后其标记的M2型巨噬细胞则减少了20%～40%,而移植于正常脊髓的M2型巨噬细胞则不出现这种减少现象。同时分别用M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞作用于损伤脊髓背根神经节(DRG)，并发现用M1型巨噬细胞作用的DRG轴突生长缓慢，而用M2型巨噬细胞的DRG轴突生长长度大约为M1型巨噬细胞组的2倍，并发现，在加入轴突生长抑制剂GSPG和MAG组中，用M2型巨噬细胞作用DRG轴突也得到了生长。这种现象说明了：①在损伤部位的微环境更倾向使巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，也可说明M1型巨噬细胞的持续存在，而M2型巨噬细胞的短暂聚集，则可导致M1型巨噬细胞持续表达的促炎症细胞因子、氧自由基、一氧化氮等导致损伤脊髓加重；②M2型巨噬细胞具有促进轴突生长作用，即使在具备轴突生长抑制剂的环境下，也能具有该能力，故M2型巨噬细胞能修复脊髓损伤。

4 存在问题与展望

巨噬细胞在脊髓继发性损伤时不同微环境下，有着不同功能。故能调节M1、M2型巨噬细胞在脊髓损伤中时的极化方向，通过改变脊髓损伤部位微环境，减少M1型巨噬细胞、增加M2型巨噬细胞数量、存在时间及分布，对于脊髓损伤修复提供了一条治疗方案。

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（2015-05-25收稿）

R651.2

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.022

谢侃（1990-），男，研究生在读。E-mail：xkiaen@foxmail.com