5-氨基水杨酸对人结肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡以及细胞周期的影响

5-氨基水杨酸对人结肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡以及细胞周期的影响

邓勇彬王承党*

福建医科大学附属第一医院消化科福建医科大学消化系病研究室(350005)

背景：溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UcCRC)是溃疡性结肠炎(UC)最严重的并发症，5-氨基水杨酸(5-ASA)能降低UcCRC的发生风险。目的：探讨5-ASA对人结肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡以及细胞周期的影响，明确5-ASA对UcCRC的抑制作用。方法：以不同浓度(0、10、20、30、40 mmol/L) 5-ASA作用于HT-29细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖情况；采用TUNEL法检测细胞凋亡情况；采用流式细胞术检测细胞周期；采用免疫组化法检测细胞有丝分裂调节因子AuroraB、BubR1蛋白表达。结果：5-ASA 10、20、30、40 mmol/L组HT-29细胞增殖抑制率、凋亡率随5-ASA浓度升高而升高(P<0.05)。5-ASA 30、40 mmol/L 组G0/G1期细胞比例显著低于0、10、20 mmol/L组(P<0.05)；5-ASA 0、10、20、30 mmol/L组S期细胞比例均显著低于40 mmol/L组(P<0.05)；5-ASA 30、40 mmol/L组G2/M期细胞比例显著高于0、10、20 mmol/L组(P<0.05)。AuroraB、BubR1平均光密度(MOD)值随5-ASA浓度升高而降低(P<0.05)。5-ASA浓度与细胞增殖抑制率、凋亡率呈正相关(P<0.05)，与AuroraB、BubR1 MOD值呈负相关(P<0.05)。AuroraB、BubR1 MOD值与细胞增殖抑制率、凋亡率、G2/M期细胞比例呈负相关(P<0.05)，与G0/G1期细胞比例呈正相关(P<0.05)。AuroraB与BubR1 MOD值呈正相关(P<0.05)。结论：5-ASA可抑制HT-29细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能与5-ASA抑制AuroraB、BubR1表达，继而影响细胞周期有关。

关键词氨水杨酸；结直肠肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期；AuroraB蛋白；BubR1蛋白；HT-29细胞株

AuroraB Protein;BubR1 Protein;HT-29 Cell Line

溃疡性结肠炎相关结直肠癌(UcCRC)是溃疡性结肠炎(UC)最严重的并发症，UC患者并发结直肠癌的风险较一般人群显著增加，且与UC病程、病变范围、疾病活动度相关[1]。UcCRC的发生机制尚未完全明确，研究认为可能与全染色体不稳定性、结构染色体不稳定性、微卫星不稳定性、CpG岛甲基化有关[2]，其中全染色体不稳定性表现为细胞异常有丝分裂，非整倍体细胞增加，导致部分抑癌基因杂合性缺失。5-氨基水杨酸(5-ASA)是临床上治疗UC的一线药物，其不仅具有良好的抗炎效果，还可通过多种途径降低UcCRC的发生风险，其机制可能与对细胞周期的干扰有关。丝/苏氨酸蛋白激酶AuroraB和有丝分裂检查点蛋白BubR1是细胞有丝分裂的重要调节因子，参与细胞周期调节。本研究通过探讨5-ASA对人结肠癌细胞株HT-29增殖、凋亡以及细胞周期的影响，旨在明确5-ASA对UcCRC的抑制作用。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人结肠癌细胞株HT-29购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。5-ASA(纯度98%)(日本东京化成工业株式会社)，CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(德国罗氏诊断上海有限公司)，细胞周期检测试剂盒(美国Becton Dickinson公司)，AuroraB兔抗人多克隆抗体、BubR1兔抗人多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

二、方法

1. 细胞培养：HT-29细胞以含1%青霉素-链霉素混合液、10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基培养于5% CO2、37 ℃饱和湿度的细胞培养箱中，常规消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

2. CCK-8法检测细胞增殖情况：取对数生长期细胞制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于96孔板，于培养箱内孵育24 h后，分别加入终浓度为0、10、20、30、40 mmol/L的5-ASA溶液，每组设5个复孔，避光孵育24 h后弃培养基，加入含10 μg/L CCK-8的培养基避光孵育1.5 h。以酶标仪测定450 nm波长处各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=[1-(对照组A值-处理组A值)/(对照组A值-本底A值)]×100%。

3. TUNEL法检测细胞凋亡情况：取对数生长期细胞，以1×105/皿接种于直径3 cm的培养皿，孵育 24 h后，分别加入终浓度为0、10、20、30、40 mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24 h后加入4%多聚甲醛溶液固定60 min，3% H2O2甲醇溶液阻断 10 min，0.5% Triton X-100溶液通透15 min，滴加TUNEL工作液孵育80 min，二抗孵育30 min，DAB显色，苏木精复染。阳性细胞为细胞核呈棕黑色颗粒的皱缩细胞，光学显微镜下随机选取3个视野(×400)计数阳性细胞，计算凋亡指数(apoptosis index, AI)，AI=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。

4. 流式细胞术检测细胞周期：取对数生长期细胞，以8×105/孔接种于6孔板，孵育24 h后，换用含3%胎牛血清的培养基培养24 h(血清饥饿法)以调整细胞周期，分别加入终浓度为0、10、20、30、40 mmol/L 的5-ASA溶液，避光孵育24 h后消化为单细胞悬液，加入A液固定10 min后加入B液(RNase A酶溶液)处理10 min，最后加入C液(PI)染色 30 min 后上机检测。

5. 免疫组化法检测AuroraB、BubR1蛋白表达：取对数生长期细胞，以1×105/皿接种于直径3 cm的培养皿，孵育24 h后，分别加入终浓度为0、10、20、30、40 mmol/L的5-ASA溶液，避光孵育24 h后加入4%多聚甲醛溶液固定60 min，3% H2O2甲醇溶液 阻断10 min，0.5% Triton X-100溶液通透(AuroraB，20 min； BubR1，10 min)，山羊血清封闭25 min，加入AuroraB兔抗人多克隆抗体(1∶200)孵育90 min、BubR1兔抗人多克隆抗体(1∶300)孵育60 min，二抗孵育，DAB显色，苏木精复染。光学显微镜下随机选取3个视野(×200)，测定各组平均光密度(MOD)值。

三、统计学分析

结果

一、5-ASA对HT-29细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示，5-ASA 10、20、30、40 mmol/L 组HT-29细胞增殖抑制率分别为(8.20±3.03)%、(14.03±2.41)%、(21.05±3.33)%和(25.59±3.90)%，随5-ASA浓度升高而升高，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。

二、5-ASA对HT-29细胞凋亡的影响

TUNEL法检测结果显示，5-ASA 0、10、20、30、40 mmol/L组HT-29细胞的AI分别为(0.27±0.38)%、(7.11±1.65)%、(7.87±1.28)%、(10.63±2.31)%和(14.82±2.93)%，随5-ASA浓度升高而升高，除10 mmol/L组与20 mmol/L组间外，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)(图1)。

三、5-ASA对HT-29细胞周期的影响

流式细胞检测显示，5-ASA 0、10、20 mmol/L组间HT-29细胞G0/G1期细胞比例无明显差异(P>0.05)，30、40 mmol/L组G0/G1期细胞比例显著低于0、10、20 mmol/L组，且 40 mmol/L 组显著低于30 mmol/L 组(P<0.05)(表1)，提示10~20 mmol/L 5-ASA对G0/G1期细胞比例无明显影响，而30~40 mmol/L 5-ASA可使G0/G1期细胞比例显著减少。

5-ASA 0、10、20、30 mmol/L组间S期细胞比例无明显差异(P>0.05)，但四组S期细胞比例均显著低于40 mmol/L组(P<0.05)(表1)，提示10~30 mmol/L 5-ASA对S期细胞比例无明显影响，而40 mmol/L 5-ASA可使S期细胞比例显著增加。

5-ASA 0、10、20 mmol/L组间G2/M期细胞比例无明显差异(P>0.05)，30、40 mmol/L组G2/M期细胞比例显著高于0、10、20 mmol/L组，且40 mmol/L 组显著高于30 mmol/L组(P<0.05)(表1)，提示10~20 mmol/L 5-ASA对G2/M期细胞比例无明显影响，而30~40 mmol/L 5-ASA可使G2/M期细胞比例显著增加。

表1　不同5-ASA浓度下HT-29细胞周期分布情况

四、5-ASA对HT-29细胞AuroraB表达的影响

免疫组化法检测结果显示，AuroraB阳性染色主要表达于细胞核，呈深棕色颗粒，细胞质和细胞膜则均无表达。5-ASA 0、10、20、30、40 mmol/L组AuroraB MOD值分别为0.78±0.03、0.55±0.03、0.53±0.04、0.47±0.03和0.36±0.02，随5-ASA浓度升高而降低，除10 mmol/L组与20 mmol/L组间 外，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

五、5-ASA对HT-29细胞BubR1表达的影响

免疫组化法检测结果显示，BubR1阳性染色主要表达于细胞质，呈棕黄色颗粒，细胞核中有少量表达。5-ASA 0、10、20、30、40 mmol/L组BubR1 MOD值分别为0.31±0.01、0.26±0.02、0.26±0.01、0.24±0.02和0.22±0.01，随5-ASA浓度升高而降低，10、20、30、40 mmol/L组间差异无统计学意义(P>0.05)，但均显著低于0 mmol/L组(P<0.05)(图3)。

六、5-ASA浓度与HT-29细胞增殖、凋亡以及AuroraB和BubR1蛋白表达的关系

Spearman相关分析显示，5-ASA浓度与HT-29细胞增殖抑制率(rs=0.91，P=0.00)、凋亡率(rs=0.89，P=0.00)呈正相关，与AuroraB MOD值(rs=-0.96，P=0.00)、BubR1 MOD值(rs=-0.86，P=0.00)呈负相关。

七、AuroraB、BubR1蛋白表达与HT-29细胞增殖、凋亡以及细胞周期的关系

A：5-ASA 0 mmol/L组；B：5-ASA 10 mmol/L组；C：5-ASA 20 mmol/L组；D：5-ASA 30 mmol/L组；E：5-ASA 40 mmol/L组

A：5-ASA 0 mmol/L组；B：5-ASA 10 mmol/L组；C：5-ASA 20 mmol/L组；D：5-ASA 30 mmol/L组；E：5-ASA 40 mmol/L组

A：5-ASA 0 mmol/L组；B：5-ASA 10 mmol/L组；C：5-ASA 20 mmol/L组；D：5-ASA 30 mmol/L组；E：5-ASA 40 mmol/L组

Pearson相关分析显示，AuroraB、BubR1 MOD值与HT-29细胞增殖抑制率(r=-0.81，P=0.00；r=-0.70，P=0.00)、凋亡率(r=-0.93，P=0.00；r=-0.89，P=0.00)、G2/M期细胞比例(r=-0.76，P=0.00；r=-0.73，P=0.00)呈负相关，与G0/G1期细胞比例(r=0.75，P=0.00；r=0.74，P=0.00)呈正相关。AuroraB与BubR1 MOD值呈正相关(r=0.894，P=0.00)。

讨论

5-ASA应用于炎症性肠病(IBD)的治疗至今已30余年，其不仅能有效控制结肠黏膜炎症，还能通过调控COX-2/PGE2、EGFR、NF-κB、Wnt/β-catenin信号通路、调节细胞周期相关蛋白表达、提高细胞复制的保真度等途径实现对UC癌变的化学预防效应[3]。

5-ASA是治疗UC的基础药物，有口服和灌肠两种剂型，二者在临床上多联合应用。治疗UC时，5-ASA剂量为2~4 g/d，当5-ASA剂量>1.2 g/d时，可使UcCRC发生率降低[4]。5-ASA的结肠黏膜内浓度为其有效治疗浓度，而结肠腔内药物浓度可间接反映黏膜内浓度。每日服用2 g 5-ASA的UC缓解期患者，结肠腔内5-ASA浓度约为20 mmol/L[5]，其肠腔内浓度除与口服剂量有关外，尚与剂型相关。故本研究选择0、10、20、30、40 mmol/L 5-ASA，模拟UC患者口服5-ASA后的结肠腔内药物浓度，探讨该浓度5-ASA作用下人结肠癌细胞株HT-29的增殖、凋亡情况、细胞周期以及丝/苏氨酸蛋白激酶AuroraB、有丝分裂检查点蛋白BubR1的表达情况。

本研究结果显示，5-ASA在0~40 mmol/L范围内可浓度依赖性地抑制HT-29细胞增殖、促进细胞凋亡，推测可能与5-ASA通过增强磷酸化表皮生长因子受体靶磷酸酶(SH-PTP2)活性以介导EGFR脱磷酸化、阻断EGFR信号通路、激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、引起有丝分裂阻滞、诱导caspase依赖性细胞凋亡等因素有关[6-8]。目前，研究对5-ASA引起细胞周期阻滞的阶段尚存在争议。Reinacher-Schick等[8]的研究显示，5-ASA能浓度依赖性地调节细胞周期，使细胞周期阻滞于G2/M期。然而Stolfi等[9]的研究显示，5-ASA通过降低细胞周期蛋白CDC25A表达抑制结直肠癌细胞由S期向G2期转换，导致S期细胞积聚。本研究结果显示，HT-29细胞经较高浓度(≥30 mmol/L)5-ASA作用后，G0/G1期细胞数量减少、S期和G2/M期细胞数量增加，即出现S期和G2/M期阻滞，提示G1/S期转换受阻、有丝分裂检查点等细胞周期卡点跨越异常；经10~20 mmol/L 5-ASA作用的HT-29细胞S期和G2/M期阻滞效应不明显，提示低浓度5-ASA对HT-29细胞的细胞周期几乎无影响，其对细胞增殖的抑制和促凋亡作用可能系通过COX-2/PGE2通路等其他途径完成。然而，本研究中5-ASA的作用时间仅为24 h，因此不排除低浓度长时间作用下细胞周期可进一步发生改变，后期需研究药物浓度、作用时间双重因素对HT-29细胞周期的影响。

AuroraB基因位于染色体17p13，其编码产物AuroraB蛋白主要表达于细胞核，具有丝/苏氨酸激酶活性，与着丝粒中心蛋白(INCENP)、borealin、survivin构成染色体载体复合物，参与染色体-微管连接、微管张力感知、姐妹染色体分离以及细胞质分裂等事件[10]。AuroraB的表达具有时间性和空间性，其出现于细胞周期S期，在有丝分裂中-晚期转换前存在于姐妹染色体着丝粒上，在有丝分裂晚期和末期存在于纺锤体中央区[11]。Nguyen等[12]的研究发现，上皮细胞中AuroraB高表达可促进四倍体产生增多，诱导上皮细胞肿瘤形成。Tuncel等[13]的研究显示，结直肠癌组织中AuroraB表达升高，其表达水平与淋巴结转移相关。Azzariti等[14]的研究显示，AuroraB抑制剂可使结肠癌细胞染色体数目明显增加，改变细胞周期，诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤效应。本研究结果显示，HT-29细胞的AuroraB蛋白表达水平呈5-ASA浓度依赖性降低，尤以30、40 mmol/L 5-ASA组为著，伴5-ASA浓度依赖性细胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期细胞周期阻滞，提示较高浓度的5-ASA可通过某种途径降低AuroraB表达，干扰有丝分裂，从而发挥抗癌效应。5-ASA预防UcCRC的进程中是否存在类似效应，有待进一步研究。

BubR1蛋白由有丝分裂检查点Mad基因家族Bub1b基因编码，位于染色体15q14~21，由23个外显子组成，启动子区有众多转录因子结合位点。BubR1在正常结肠上皮中仅表达于细胞质，但在结肠腺癌细胞中，除表达于细胞质外，在细胞核中亦有所表达，参与形成微管-着丝粒连接、与Bub1、Bub3、Mad2等蛋白形成有丝分裂检查点复合物、与p53相互作用参与修复细胞纺锤体损伤[15-16]。Wei等[17]的研究发现，BubR1表达缺失可加速胚胎细胞有丝分裂中晚期转换，使异倍体增加。Rao等[18]的研究显示，BubR1表达缺失可促进结肠肿瘤发生。然而本研究中，HT-29细胞经不同浓度5-ASA作用后，BubR1表达呈浓度依赖性降低，伴HT-29细胞增殖抑制、凋亡增加和G2/M期细胞周期阻滞。在人肿瘤细胞中，与其他有丝分裂检查点蛋白一样，BubR1出现基因突变的概率非常小，Tighe等[19]的研究显示异倍体结肠癌细胞的有丝分裂检查点无异常改变。Roschke等[20]认为，BubR1等组成的有丝分裂检查点异常改变并非细胞癌变的起始因素，而是通过促进原癌基因和抑癌基因突变引起细胞癌变。本研究中，HT-29细胞经5-ASA作用后阻滞于G2/M期，说明有丝分裂检查点功能正常，BubR1表达降低并未弱化有丝分裂检查点功能。本研究结果显示HT-29细胞的BubR1与AuroraB表达水平呈正相关，考虑与BubR1、Mad2、Bub1、Cenp-E等有丝分裂检查点蛋白募集至着丝粒需AuroraB活化有关，提示经5-ASA作用后，HT-29细胞AuroraB表达降低，导致其对BubR1的活化、募集减少。此外，BubR1启动子区含有Sp1、Nkx-2、CdxA、SRY、MyoD、Ik-2、HNF-3b、Staf、Oct-1、Nkx-2、v-Myb、AML-1a等诸多转录因子结合位点，故不排除其他通路参与5-ASA对BubR1的表达抑制。

综上所述，本研究结果显示，在一定浓度范围内，5-ASA可以浓度依赖性的方式降低HT-29细胞的AuroraB和BubR1表达，伴G0/G1期细胞数量减少、G2/M期细胞数量增加、细胞增殖抑制、凋亡增加。由此可见，5-ASA可抑制HT-29细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能与5-ASA抑制AuroraB、BubR1表达，继而影响细胞周期有关，这可能是5-ASA抑制UcCRC发生的作用机制之一。

参考文献

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(2014-08-01收稿；2014-10-02修回)

·论著·

Effect of 5-Aminosalicylic Acid on Cell Proliferation, Apoptosis and Cell Cycle in Human Colon Cancer Cell Line HT-29DENGYongbin,WANGChengdang.DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity;InstituteofDigestiveDiseases,FujianMedicalUniversity,Fuzhou(350005)

Correspondence to: WANG Chengdang, Email: wangcdhl@sina.com

Background: Ulcerative colitis-associated colorectal cancer (UcCRC) is the most serious complication of ulcerative colitis (UC). 5-Aminosalicylic acid (5-ASA) could reduce the risk of UC progressing to UcCRC. Aims: To investigate the effect of 5-ASA on cell proliferation, apoptosis and cell cycle in human colon cancer cell line HT-29 for verifying the inhibitory effect of 5-ASA on UcCRC. Methods: HT-29 cells were treated with different concentrations (0, 10, 20, 30, 40 mmol/L) of 5-ASA. Cell proliferation was measured by CCK-8 assay. Cell apoptosis was determined by TUNEL method. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. Expressions of cell mitotic regulators AuroraB and BubR1 were determined by immunohistochemistry. Results: Proliferation inhibition rates and apoptosis rates of HT-29 cells in 5-ASA 10, 20, 30, 40 mmol/L groups were increased with increase in concentration of 5-ASA (P<0.05). Proportions of cells in phase G0/G1 in 5-ASA 30, 40 mmol/L groups were significantly lower than those in 5-ASA 0, 10, 20 mmol/L groups (P<0.05); proportions of cells in phase S in 5-ASA 0, 10, 20, 30 mmol/L groups were significantly lower than that in 5-ASA 40 mmol/L group (P<0.05); while proportions of cells in phase G2/M in 5-ASA 30, 40 mmol/L groups were significantly higher than those in 5-ASA 0, 10, 20 mmol/L groups (P<0.05). Mean optical density (MOD) values of AuroraB and BubR1 were decreased with increase in concentration of 5-ASA (P<0.05). Concentration of 5-ASA was positively correlated with proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HT-29 cells (P<0.05), but was negatively correlated with MOD values of AuroraB and BubR1 (P<0.05). MOD values of AuroraB and BubR1 were negatively correlated with proliferation inhibition rate and apoptosis rate of HT-29 cells as well as proportion of cells in phase G2/M (P<0.05), but were positively correlated with proportion of cells in phase G0/G1 (P<0.05). MOD value of AuroraB was positively correlated with MOD value of BubR1 (P<0.05). Conclusions: 5-ASA can inhibit proliferation and induce apoptosis in HT-29 cells, the mechanism may be related to inhibiting expressions of AuroraB and BubR1 and the resulted effect on cell cycle.

Key wordsMesalamine;Colorectal Neoplasms;Cell Proliferation;Apoptosis;Cell Cycle;

通信作者*本文，Email: wangcdhl@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.03.002