响应面优化长裙竹荪总黄酮提取工艺研究

2015-02-20许远魏和平吴彦

长江大学学报(自科版) 2015年15期

关键词：竹荪长裙液料

许远，魏和平，吴彦

(安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011)

响应面优化长裙竹荪总黄酮提取工艺研究

许远，魏和平，吴彦

(安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆246011)

[摘要]通过单因素试验探讨了乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度对长裙竹荪(Dictyophoraindusiata)总黄酮得率的影响，并进一步通过响应面分析对超声波辅助乙醇提取长裙竹荪总黄酮的最佳工艺条件进行了优化，得出最佳工艺条件为：乙醇浓度75.5%，液料比16.5∶1，超声时间19min，超声温度56℃。在此工艺条件下，长裙竹荪总黄酮得率达到3.03mg/g。

[关键词]长裙竹荪(Dictyophoraindusiata)；总黄酮；响应面

黄酮类化合物是一类天然抗氧化化合物[1]，具有清除自由基、抗菌、防癌、防止毛细管渗透、镇痛等多种生物活性功能[2，3]。现代社会“高脂肪、高蛋白、高能量”的饮食结构带来癌症、心血管等多种疾病高发，食物来源的黄酮天然、低毒、高效，对于此类疾病的防治功效显著[4]。营养学研究显示，众多品种食用菌不仅富含多糖、多酚等生物活性物质，也具有高含量的黄酮类化合物[5～8]。竹荪(Dictyophpraspp.)是一类名贵大型食用真菌，营养丰富，口味鲜美独特，素有 “真菌皇后”、“山珍之王”等美称，历代列为贡品，在现代亦成为食疗佳品[9]。目前，针对竹荪黄酮类化合物提取工艺的研究尚未见报道。因此，本研究通过超声波辅助乙醇提取法对长裙竹荪子实体叫黄酮含量进行了测定，并采取响应面分析方法对其提取工艺进行了优化，旨在为进一步开发利用竹荪黄酮类化合物提供技术基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

长裙竹荪子实体干粉为市售，以粉碎机粉碎，过60目筛，制成干粉，储存于冰箱(0～4℃)备用。

试剂：芦丁标准品(>98%)，合肥博美生物科技有限责任公司；无水乙醇、盐酸、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等均为分析纯。

仪器：FA2004B电子天平(上海越平科学仪器有限公司) ；手提式多功能粉碎机(上海广沙工贸有限公司)；DZ-2BCⅡ真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RE-2000旋转蒸发器(上海洪旋实验仪器有限公司)；SY-360型台式数控超声波提取机(昆山市超声仪器有限公司)；UV759紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

1.2试验方法

1.2.1标准曲线绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法[10]，得标准曲线回归方程：D= 3.5033C+ 0.3718(D为光密度，C为芦丁浓度)，R2= 0.9968，表明了芦丁在浓度0～0.3mg/mL之内线性关系良好。

1.2.2长裙竹荪总黄酮提取工艺流程

长裙竹荪→晾干→粉碎→过筛→称量→混合乙醇溶液→超声处理→回流提取→浓缩→长裙竹荪滤液

取2mL上述滤液于10mL容量瓶中，以制备标准曲线的方法，在 510nm 处测定其光密度，并根据标曲回归方程计算长裙竹荪总黄酮得率，重复3次，取平均值，计算公式如下：

式中：C为提取液中总黄酮浓度，mg/mL；V1为显色时定容体积，mL；V2为显色时取样体积，mL；V为提取液总体积，mL；m为原料质量，g。

1.2.3单因素试验

以乙醇浓度、液料比、超声温度、超声时间4个因素为研究对象，以长裙竹荪总黄酮得率为指标，进行单因素试验。每因素试验时，待测因素按表1依次取值，其他因素固定取值如下：乙醇浓度70%、液料比12∶1、超声温度50℃、超声时间15min。

表1　单因素取值水平

1.2.4响应面法对提取工艺参数的优化与验证

在单因素试验结果的基础之上，根据 Box-Benhnken 中心组合实验设计原理，运用 Design Expert 8.0 软件设计响应面试验，分别选择乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)作为自变量，以长裙竹荪总黄酮的得率(R1) 作为响应值设计响应面试验，以此分析各因素间交互作用对长裙竹荪总黄酮得率的影响，因素水平取值见表2。

表2　响应面设计因素和水平

1.3数据处理

采用 Microsoft Excel 2003软件整理数据，Design Expert 8.0 软件进行数据分析。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇浓度的选择

图1显示,总黄酮得率随乙醇浓度升高而上升，达到 75%后略呈下降趋势。原因可能是黄酮类物质属弱极性化合物，当溶剂与提取物极性趋近时，提取物更易从细胞中溢出[11]，乙醇是提取黄酮的优良有机溶剂之一[12]，75%的乙醇溶液极性可能与长裙竹荪黄酮的极性最为相似，故在此浓度下提取率最高。而当浓度高于75%后，溶剂极性与提取物极性差异逐渐增大，导致溶解度降低，进而影响得率[13]。故乙醇浓度选用70%～80%进行响应面实验分析。

2.1.2液料比的选择

图2 显示：总黄酮得率随液料比的增加不断增大，大于16∶1后曲线略有下降并逐渐平稳。原因可能是随液料比的增大，使得浓度差提高，有利于传质，提取越来越充分，而当黄酮的溶出已基本达到平衡时，即便再增加溶剂量，也不能再增加得率，且由于溶剂量的增大，还可能使得一些非黄酮类的化合物溶解度增大，与黄酮类化合物形成了一定的竞争关系，从而导致提取含量减少。故液料比选用14∶1 ～18∶1进行响应面实验分析。

图1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响图2 液料比对总黄酮得率的影响

2.1.3超声时间的选择

图3显示：总黄酮得率随超声波作用时间的增加而升高，大于20min 后总黄酮得率呈平缓下降趋势。原因是超声波的空化作用可充分破坏植物细胞，加速胞内物质释放溶解，增大提取效率[14，15]，但过长的超声时间可能会破坏黄酮类化合物的有效结构，导致降解。故超声时间选用15～25min进行响应面实验分析。

2.1.4超声温度的选择

图4显示：总黄酮得率随超声温度的升高呈上升趋势，达到55℃后趋于下降。原因是较高的温度可能破坏样品中黄酮类物质的结构而造成损失，同时高温导致提取液的挥发量增加，从而导致得率下降。故超声温度选用50～60℃ 为宜。

2.2响应面法确定长裙竹荪总黄酮的最佳提取条件

2.2.1响应面法试验设计及结果

选择乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)、及超声温度(D) 作为自变量，以长裙竹荪总黄酮的得率(R1) 作为响应值设计响应面试验，结果见表3。

表3　响应面试验结果

利用Design Expert 8.0软件对表2的数据进行多元回归分析，拟合后得到A、B、C、D的二次多项回归模型为：

长裙竹荪总黄酮得率(mg/g)= 0.80183A+1.45092B+0.90243C+1.16123D-7.00000×10-3AB-3.20000×10-3AC+3.10000×10-3AD+1.25000×10-3BC+1.25000×10-3BD-5.50000×10-3CD-5.25667×10-3A2-0.029417B2-8.20667×10-3C2-0.011657D2-80.84067

对上述方程进行方差分析，结果如表4所示。

结果显示，模型显著性检验P值< 0.0001，为极显著，失拟项P值为0.0664>0.05，不显著，无失拟因素存在。该回归方程相关系数R2=0.9990，校正决定系数R2Adj=0.9980，说明该模型能够解释99.90%的变化，因变量与所选自变量之间线性关系显著。以上证明该模型与试验拟合度良好，可用该模型代替真实实验对实验结果进行预测和分析。

模型的一次项A、B、C、D为极显著;二次项A2、B2、C2、D2为极显著；交互项AB、AC、AD、CD为极显著，BC、BD为显著，由此可知，自变量与响应值之间非简单线性关系。通过F值可知，各单因素对长裙竹荪总黄酮得率的影响程度依次为：超声温度>超声时间>液料比>乙醇浓度；各两因素交互作用对长裙竹荪总黄酮得率的影响程度依次为：超声时间和超声温度>乙醇浓度和超声时间>乙醇浓度和超声温度>液料比和乙醇浓度>液料比和超声时间=液料比和超声温度。

表4　回归模型方差分析

注：* 表示P<0.05,**表示P<0.001。

2.2.2响应面分析

图5是按所得数学模型绘制的响应曲面图，响应曲面的坡度变化及其等高线反映了各因素间交互作用效应。其坡度直接反映了在处理条件下发生变化时长裙竹荪总黄酮得率的响应灵敏程度，如坡度相对平缓，响应值不敏感；反之，如坡度相对陡峭，响应值敏感。响应值随哪种因素的变化率更大，说明该因素在二者交互作用中对长裙竹荪总黄酮得率的影响更大。等高线为椭圆形，说明两因素交互作用显著，若偏圆形，说明不太显著。

从图5f可知，其等高线为椭圆形，说明超声时间和超声温度交互作用显著；响应面坡度较为陡峭，响应值随超声温度的变化率大于超声时间的变化率，说明在二者交互作用中超声温度对总黄酮得率影响大于超声时间。而从图5d可知，其等高线较其他偏圆形，说明液料比和超声时间交互作用不太显著；响应面坡度相对平缓，响应值随超声时间的变化率大于液料比的变化率，说明在二者交互作用中超声时间对总黄酮得率影响大于液料比。综合所有响应面图分析，超声时间和超声温度的交互作用最显著，乙醇浓度和超声时间、乙醇浓度和超声温度、乙醇浓度和液料比次之，液料比和超声时间、液料比和超声温度最不显著，其中超声温度和超声时间较之乙醇浓度和液料比对响应值的影响更大，此结果与模型中F值分析结果一致。

2.2.3条件优化

根据响应面分析表明：最佳提取工艺理论值是乙醇浓度75.48%，液料比16.29∶1，超声时间19.17min，超声温度56℃。考虑到实际操作的便利，将长裙竹荪中总黄酮提取的最佳工艺条件修正为：乙醇浓度75.5%，液料比16.5∶1，超声时间19min，超声温度56℃。按照修正后的条件下进行3次验证试验，结果如表5 所示，长裙竹荪总黄酮得率实验值为3.03mg/g，与预测值3.03mg/g一致，表明试验结果理想，试验模型选择合理。

图5　各因素对总黄酮得率影响的响应面分析

项目序号123平均值总黄酮得率/(mg·g-1)3.023.043.033.03

3结论

目前，提取黄酮类化合物的方法主要

有水浸提法、酶解法、超临界萃取法、微波辅助提取法与超声波辅助提取法等[16～20]，超声波辅助提取法因操作简单、方便、能耗低、无副产物等优点而备受青睐[21]，许多研究者依据此法获得了准确的数据，如罗彩林等[22]利用超声波辅助提取法进行大米草总黄酮提取工艺研究，赵强等[23]利用该法进行了苦荞皮总黄酮提取的工艺优化,王辰等[24]也利用该法进行了葛根黄酮的提取。

因此，本研究采用超声波辅助乙醇提取法提取长裙竹荪总黄酮，根据中心组合设计原理，采用4 因素3 水平的响应面分析，得出了长裙竹荪总黄酮的最佳提取工艺条件：乙醇浓度75.5%，液料比16.5∶1，超声时间19min，超声温度56℃，在此条件下测得长裙竹荪总黄酮含量为3.03mg/g，可为进一步研究竹荪黄酮类化合物提供技术基础。

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