UPLC指纹图谱在烟用香精质量控制中的应用研究

李源栋，刘秀明，段焰青，张翼鹏，王文元，者 为，王家俊，夏建军

（云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650202）

UPLC指纹图谱在烟用香精质量控制中的应用研究

李源栋，刘秀明，段焰青，张翼鹏，王文元，者 为，王家俊，夏建军

（云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650202）

为快速有效地控制不同批次烟用香精的质量，采用超高效液相色谱法（UPLC）法对同种香精9个不同批次样品的成分进行分析，通过计算色谱峰的相对保留值（a）和相对峰面积（Sr）建立香精样品的指纹图谱，并通过指纹图谱的聚类分析和主成分分析对样品进行模式识别。结果表明：聚类分析和主成分分析能够区分稀释及掺兑的香精样品，验证该方法的准确、可行性，可以作为香精质量稳定性控制的一种有效手段。

香精；超高效液相色谱；指纹图谱；聚类分析；主成分分析

0 引 言

在卷烟的生产过程中，为了提高卷烟的燃吸品质，改善卷烟口感，突出烟草风格，需要使用各种烟用香精[1]。烟用香精是由多种香料和适量溶剂调和制成的混合物，受原料产地、加工工艺等多种因素影响，产品质量存在一定的波动性。因此，烟用香精质量的稳定性倍受香精生产企业和卷烟企业的关注。以往大多卷烟生产企业主要通过香精的酸度、溶混度、折光指数、挥发性总量以及旋光度等物性指标和人工品吸来对香精质量进行控制，但这些方法很难反映出香精内在化学成分变化，给质量控制带来困难[2-4]。指纹图谱法通过对样品色谱峰的相对保留值和其相应的色谱峰峰面积进行量化处理，实现谱图数据化，提高样品间的可比性[5]。目前建立烟用香精的指纹图谱分析方法主要是通过气相色谱法[6]、气相色谱-质谱联用法[7-8]和液相色谱法[9-11]，但是这些方法都存在一定的局限性；气相色谱主要用于检测香精中的挥发性和半挥发性成分，液相色谱主要用于检测香精中的难挥发性成分，而烟用香精中存在很多难挥发成分，这些成分有可能发挥关键作用。超高效液相色谱（UPLC）技术主要应用于药物、食品、化妆品等方面的研究[12-14]，与传统的液相色谱技术相比，UPLC能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究[15]。因此，本文采用超高效液相色谱法建立了A烟用香精样品的指纹图谱，通过稀释及掺兑实验结合聚类分析和主成分分析对香精样品进行了模式识别，旨在为烟用香精的质量控制提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器设备及试剂

Waters超高压液相色谱仪（美国Waters公司），配备二极管阵列检测器（PDA）和Empower色谱工作站；电子分析天平（感量0.1 mg）；MILLI.Q纯水机（MILLIPORE公司）。

乙腈、无水乙醇、甲酸均为色谱纯；丙二醇、萘为分析纯；超纯水；9批次A烟用香精（红云红河集团香精香料制备中心提供），记为1#～9#。

1.2 含内标的萃取溶液

准确称取萘标准品1 g左右于烧杯中，精确至0.1mg，用适量的乙腈溶解，并定容于100mL的容量瓶中，密封保存在-5℃的冰箱中。

取10 mL上述标准溶液于1 000 mL的容量瓶中，用超纯水、乙腈等体积混合的溶液定容，作为萃取溶液，此溶液萘质量浓度为150.25μg/mL。

1.3 样品前处理

准确称取1.0g样品于50mL锥形瓶中，精确至0.1mg，准确加入10mL萃取溶液，室温下超声15min。取适量溶液过0.22μm有机相滤膜，待分析。

1.4 烟用香精的稀释实验

用1：1（乙腈/水，V∶V）稀释液将其中任意一批A香精样品稀释为90%，80%，70%（体积分数）的样品，记为10#，11#，12#，分别取1.0g上述样品于50mL锥形瓶中，精确至0.1 mg，准确加入10 mL萃取溶液，室温下超声15min。取适量溶液过0.22μm有机相滤膜，待分析。

1.5 烟用香精的掺兑实验

在A类香精样品中分别掺入其他香精样品15%，25%，50%（体积分数），记为13#，14#，15#。分别取1.0g上述样品于50mL锥形瓶中，精确至0.1mg，准确加入10mL萃取溶液，室温下超声15min。取适量溶液过0.22μm有机相滤膜，待分析。

1.6 液相色谱分析条件

液相色谱柱：UPLC BEH C18（2.1mm×100mm× 1.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸，流动相B：乙腈；柱温为30℃；流量为0.2 mL/min；检测波长为275 nm；进样量：2μL；洗脱方式：梯度洗脱（见表1）。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂

萃取溶剂需对香精香料样品有良好的溶解性，能最大限度地避免有效成分的损失，保留样品中的各种成分，而且具有较强的峰形，使指纹图谱能更全面准确地反映出产品的特征，监控每一种物质的变化。由于香精的成分比较复杂，因此使用单一溶剂很难将香精中的成分完全溶解，考虑烟用香精中使用比较多的溶剂，如丙二醇、乙醇、甲醇、乙腈，本文通过对比实验，最终确定使用等体积的乙腈/水混合溶剂作为溶解香精的溶剂。

2.2 色谱柱的优选

分别采用UPLC HSS T3（1.0mm×100mm×1.8μm）、Kinetex C18（2.1mm×150mm×1.7μm）、UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）、UPLC BEHC18（2.1 mm× 50 mm×1.7 μm）等色谱柱作为分离柱，结果发现UPLCBEHC18（2.1mm×100mm×1.7μm）色谱柱对A香精样品特征峰的分离效果较好。

2.3 检测波长优选

通过PDA 200～400nm全扫描，发现检测波长为230nm以下时，由于其靠近流动相的截止波长，溶剂吸收明显，基线在分析过程中有提升现象。检测波长为275nm时，A香精样品色谱峰数都较多，且响应值较高，所以检测波长选择275nm比较适宜。

2.4 精密度和稳定性实验

同一样品连续进样5次，各个色谱峰相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差均小于3%。每天一次，连续5d对同一样品进行分析，各个色谱峰相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差均小于5%。则说明该方法具有较好的精密度和稳定性。

2.5 烟香精指纹图谱建立及评价

色谱研究中，相对保留时间相同的峰，即为共有峰。由表2可以看出，11个色谱峰为9个批次A香精样品所共有，共有指纹峰的峰面积均占总峰面积96%，因此可选择这11个色谱峰作为判别A香精的群体特征峰，以萘内标峰作为内参照峰求出共有指纹峰的相对保留时间a值和相对峰面积Sr值（见表2），并建立A类香精的标准指纹图谱（见图1）。

图1 A香精样品的UPLC指纹图谱

表2 9批次A香精共有峰及相似度

相似度反映供试样品与标准指纹图谱之间的相似程度，可以用于样品的鉴别，通常采用欧氏距离、相关系数、夹角余弦等方法来计算各个样品之间的相似度[16]。本实验采用夹角余弦法计算出各图谱的相似度。实验结果如表2所示，9个批次的A香精样品的指纹图谱相似度均在0.999以上，说明所选样品存在较高的相似度，所建立的指纹图谱准确可靠。

2.6 指纹图谱的模式识别

指纹图谱法通过对样品色谱峰的相对保留值和其相应的色谱峰峰面积进行量化处理，实现谱图数据化，提高样品间的可比性，其反映的化学成分信息具有高度选择性，综合表现成物质自身的“化学条码”，可用于区别物质的真伪。本文根据色谱峰的相对峰面积，对9批次A香精样品、3个稀释香精样品及3个掺兑样品进行聚类分析和主成分分析。

图2 香精样本的聚类分析

图3 香精样本指纹图谱的主成分二维投影

利用统计学软件中聚类、主成分分析程序对上述9批次A类香精样品、稀释样品及掺兑样品的指纹图谱数据进行聚类分组和主成分分析。图2是对上述15个样品进行聚类分析的结果，聚类树状图直观地显示了15个样品逐步合并的过程，其中聚类树状图上横坐标为临界值即为类间的距离，纵坐标为样品号。临界值越小，表示样品的相似度越高，在临界值约为1.5时，15个样品被分成3类，9批次A类香精样品、稀释香精样品及掺兑样品各自聚在一起，并且随着临界值的增大，15个香精样品逐步合并聚成一类，这种聚类的规律与样品的差异性保持一致，因此，通过聚类分析能够准确区分标准香精样品、稀释香精样品及掺兑样品。图3为15个样品的散点图，其中图上每一个散点分别代表一个样品，点与点之间的距离代表各个样品之间存在的特征差异程度。可以看出，9个标准香精样品均聚集于图中的右侧部分，构成一个较为独立的组群，表明9批次香精样品具有明显的相似性。其余稀释样品和掺兑样品聚集在图左侧，与9批次香精样品相比，呈现出明显的差异性，这与聚类分析结果一致。

3 结束语

本文采用UPLC建立了A类香精的色谱指纹图谱，采用夹角余弦计算其相似度，并针对烟用香精的有效含量问题进行了稀释及掺兑，通过化学计量学中主成分分析和聚类分析的模式识别方法对同种香精样本、稀释样本及掺兑进行分类，取得了满意的结果。本方法为探讨香精质量稳定性的控制提供了一种新的途径。

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Studies on UPLC fingerprints in tobacco flavor quality control

LI Yuandong，LIU Xiuming，DUAN Yanqing，ZHANG Yipeng，WANG Wenyuan，ZHE Wei，WANG Jiajun，XIA Jianjun
（Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming 650202，China）

To quickly and effectively control the quality of different batches of tobacco flavor.Use the ultra-high performance liquid chromatography（UPLC）to analyze the ingredients of nine sample batches of flavor of a sort;establish flavor sample fingerprints to calculate the relative retention value（a）and relative peak area（Sr）of chromatographic peak；and carry out pattern recognition for samples based on clustering and principal component analysis of the fingerprint.The above clustering and principal component analysis can distinguish the diluted flavor samples from mixed ones.This method is accurate and reliable and can be used as an efficient means for stability control of tobacco flavor quality.

tobacco flavor；UPLC；fingerprint；clustering analysis；principal component analysis

A

：1674-5124（2015）05-0050-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.05.013

2014-09-26；

：2014-11-29

云南中烟工业有限责任公司资助项目（2014JC07）

李源栋（1985-），男，湖南永顺县人，硕士，主要从事烟用香精香料研究工作。