强直性脊柱炎患者不同活动期Treg、Th17细胞的临床意义及其相关性*



强直性脊柱炎患者不同活动期Treg、Th17细胞的临床意义及其相关性*

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1835.008.html

王作龙1, 钟乃风2, 马莉1**

(1.贵阳医学院附院 中心实验室, 贵州 贵阳550004； 2.贵阳医学院 生物与工程学院生物技术教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨强直性脊柱炎(AS)不同活动期调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)的临床意义，分析两者之间的相关性。方法: 78例AS患者(AS组)分为低活动性AS组和高活动性AS组，30例健康体检者作为对照组，抽取两组受检者外周血，应用细胞内因子染色技术及流式细胞术检测外周血Treg和Th17细胞数量，分析Treg和Th17与AS活动性的相关性。结果: 与对照组相比，AS组和低活动性AS组外周血Treg细胞百分率的差异无统计学意义(P>0.05)，高活动性AS组外周血Treg细胞百分率明显降低(P<0.01)，AS组外周血Th17细胞百分率增高(P<0.01)，且低活动性AS组和高活动性AS组外周血Th17细胞百分率均增高(P<0.05)，AS组、低活动性AS组以及高活动性AS组外周血Th17/Treg的细胞比值均有增高(P<0.01)；与低活动性AS组相比，高活动性AS组外周血Treg细胞明显减少(P<0.01)，高活动性AS组外周血Th17细胞明显增高(P<0.01)，高活动性AS组外周血Th17/Treg的细胞比率明显增高(P<0.01)；相关性分析显示，AS患者外周血Th17细胞比例与Bath强直性脊柱炎病情活动指数(BASDI)呈正相关，(r=0.409)Treg细胞比例与BASDI呈负相关(r=-0.265)，Th17/Treg比率与BASDI相关性分析呈显著正相关(r=0.459，P<0.01)。结论: AS患者外周血Treg、Th17细胞数量的改变，与AS的发生、发展有明显相关性，检测AS患者外周血Treg、Th17细胞的数量以及Thl7/Treg的比率有助于AS病情的判断。

[关键词]辅助性T细胞17； 调节性T细胞； 脊柱炎，强直性； 免疫，细胞； 自身免疫疾病

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性自身免疫性疾病,其准确的发病机理目前尚未可知[1]。病因有遗传假说、DNA甲基化、细菌感染假说、免疫假说，未折叠蛋白反应假说等[2-3]。有文献报道在AS的发生和发展中，T细胞亚群失衡起到了关键作用[4]。按照 CD4+T 细胞分化和功能性将其分为辅助性T细胞17(Th17)及发挥负调节功能的T细胞(regulatory T cells，Treg)等亚群。有研究发现AS患者外周血Th17细胞明显增高而Treg细胞降低，本研究通过检测AS患者外周血中Treg、Th17及其Th17/Treg比率，分析其与AS活动性的相关性，为AS的临床诊断及治疗提供新思路和新方法。

1材料与方法

1.1研究对象

78例AS患者作为研究组，30例健康体检者作为对照组。AS患者中男性65例，女性13例，年龄17～53岁，平均(26±7.8)岁；患者均为HLA-B27阳性，均符合1984年纽约修订的AS的诊断标准，均未经任何治疗。排除标准：就诊前6个月内未用过糖皮质激素，排除合并其他与AS相关的疾病(肝硬化、肿瘤等)，无风湿病及其他自身免疫病。抽血前，所有AS受试者均自愿签署知情同意书，填写病例调查表以及Bath AS功能指数(BASFI)、Bath AS病情活动指数(BASDAI)表格。依据Bath AS病情活动指数，将AS组分为低活动性AS组(BASDI<4分，44例)、高活动性AS组(BASDI≥4分，34例)。两组患者年龄及性别构成差异无统计学意义(P>0.815)。30名健康体检者中男性16名、女性14名，年龄15～52岁，平均(25±8)岁，无HIV感染，无重大疾病史。对照组与AS组年龄及性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1标本采集受检者均于早上8～10时空腹抽取静脉血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，2 h内检测Th17、Treg细胞。

1.2.2细胞体外刺激活化取上述经EDTA-K2抗凝的静脉血，用淋巴细胞液分离密度梯度离心法获取单个核细胞，RPMI 1 640调整细胞浓度至2×106/mL,接种于6孔培养板，加入莫能霉素，使最终浓度分别为1.7 g/L、加入离子霉素，使最终浓度分别为1 g/L，加入佛波酯，使最终浓度分别为0.05 g/L。再进行37 ℃ 5% CO2细胞培养箱培养5 h。以上所用试剂均购自美国BD公司。

1.2.3CD 69检测通过检测CD3+CD8-T淋巴细胞膜表面的CD 69表达，以衡量激活效果。当CD 69表达>90%(图1)方可进行Th17细胞的检测。

1.2.4Th17细胞检测取2支试管，标记为同型管及阳性管，并分别加入CD3-FITC、CD8-PECy7抗体各20 μL，然后加入已刺激培养5 h的全血50 μL，混匀，室温避光孵育15 min；加入溶血素800 μL，混匀避光溶血3 min，再转入37 ℃水浴箱中孵育5 min，加入PBS 1 mL，混匀后1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次。加入破膜剂1 mL，混匀，45 min破膜，1 000 r/min离心5 min，弃上清，对应加入抗体标记的同型对照(-)、Th17(+)，混匀，室温避光孵育15 min；加入PBS缓冲液1 mL，充分混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次；弃上清液，加入适量PBS充分混匀，上机检测。Th17细胞的结果分别以CD3+CD8-IL-17+细胞的百分率表示。

1.2.5Treg 细胞检测取2支试管，第1管做同型对照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗体20 μL，第2管加入Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 μL，再分别加入EDTA-K2抗凝外周血50 μL，漩涡混合器充分混匀，室温避光孵育15 min，加入800 μL溶血素，充分混匀，避光溶血3 min，再转入37 ℃水浴箱中5 min，加入PBS缓冲液1 mL,1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复一次，弃上清液，加入适量PBS充分混匀，上机检测。Treg细胞的结果以CD4+CD127LOWCD25+细胞的百分率表示。

1.3统计学分析

2结果

2.1Th17、Treg细胞

与对照组相比，AS组和低活动性AS组外周血Treg细胞百分率均无显著差异(P>0.05)，高活动性AS组外周血Treg细胞百分率明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义，AS组外周血Th17细胞百分率增高(P<0.01)，差异有统计学意义，且低活动性AS组和高活动性AS组外周血Th17细胞百分率均增高(P<0.05)，差异有统计学意义，AS组、低活动性AS组、高活动性AS组外周血Th17/Treg的细胞比值均增高(P<0.01)，差异有统计学意义；与低活动性AS组相比，高活动性AS组外周血Treg细胞百分率明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义，高活动性AS组外周血Th17细胞百分率明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)，高活动性AS组外周血Th17/Treg的细胞比值明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1、图2。

2.2Th17、Treg细胞与AS活动性的相关性

AS患者外周血Th17细胞比例及Th17/Treg与Bath强直性脊柱炎病情活动指数(BASDI)呈正相关(r=0.409,r=0.459，P<0.01)；Treg细胞比例与BASDI呈负相关(r=-0.265，P<0.05)。

表1　AS组及正常对照组外周血中Treg、Th17细胞

(1)与正常对照组比较，P<0.01；(2)与低活动性AS组比较，P<0.01

3讨论

AS是一种严重的慢性炎性自身免疫性疾病，对患者的工作和生活造成了严重影响，同时也给患者的家庭和社会带来了沉重的负担，多发于男性青壮年，发病的高峰年龄为20～30 岁。

CD4+CD25+调节性Treg细胞在胸腺中分化和成熟，是一组具有免疫调节作用的细胞群[1]。通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制，主动抑制自身免疫性T淋巴细胞的活化，维持自身免疫耐受，防止自身免疫性疾病的发生。王朋等[5]发现AS患者Treg细胞上调，Crispin等[6]研究结果恰好与之相反。本研究结果显示，AS患者外周血Treg细胞低于健康对照组，与Crispin等的结论相符。

注：a为淋巴细胞收集图，b为CD3+CD8-的细胞，c为CD3+CD8-CD69-细胞，d为CD3+CD8-CD69+细胞图1　流式细胞术检测CD3+CD8-CD69+细胞(CD69细胞)设门分析方法Fig.1　determination of CD3+CD8-CD69+cells (CD69cells) with flow cytometry

注：a为正常对照，b为低活动性AS，c为高活动性AS图2　Th17和Treg细胞百分率(流式细胞术)Fig.2　The percentage ofTh17and Treg cells

Th17细胞具有分化白细胞介素(interleukin，IL)23依赖性，产生IL-17，而不产生γ-干扰素为特征的T细胞亚群，通过分泌促炎细胞因子IL-17，确保中性粒细胞分化、成熟和活化，刺激单核细胞和成纤维细胞活化来参与AS炎症反应[7]。本研究中AS患者外周血Th17细胞与AS活动性呈正相关(P<0.01),但低活动性AS组外周血Th17细胞增高并不明显，高活动性AS组外周血Th17细胞明显增高，提示Th17细胞主要介导AS活动期的炎症反应，并参与疾病的进展。本研究还发现Th17/Treg失衡与Th17数量增加优势及Treg细胞数量减少有关，与LangrishCL等结论一致[1]。进一步研究显示，外周血Treg细胞的这种减低在AS低活动性组无统计学意义，但在AS高活动性组存在显著差异，提示AS疾病早期Treg细胞仍能正常行使反馈功能，抑制炎性反应，随疾病活动性增强优势促炎细胞因子的作用下，如IL-6，刺激了Thl7细胞分化，抑制了Treg细胞的分化[8]。本研究中，AS患者Treg细胞与AS活动性呈负相关，检测AS患者外周血Treg细胞可作为判断AS疾病活动性的参考指标。但单独比较Th17细胞或Treg细胞与疾病活动性的相关性不及Th17/Treg细胞比率，联合检测Th17、Treg细胞，比较Th17/Treg细胞的失衡对研究AS疾病活动监测意义更大。

Th17、Treg细胞在人体复杂的免疫调节中起到重要作用，纠正细胞失衡、调节其功能是治疗AS的可能策略，能达到诱导病情缓解、减轻关节炎症反应的作用[9]。Th细胞功能失衡进而导致AS的发生、发展，故可通过检测Th17、Treg、细胞及Th17/Treg比例，监测AS患者的治疗及疾病活动情况。

综上所述，AS患者存在Th17、Treg细胞的失衡，随着AS疾病活动度的增高，患者体内Th17细胞介导的细胞免疫功能亢进，而Treg细胞介导的免疫抑制作用减弱，联合检测AS患者外周血Th17、Treg细胞有助于AS病程监测，对AS临床治疗有重要意义。因此，Th17、Treg细胞及Th17/Treg比例有望成为临床判断AS病情的有效指标，可能为AS诊疗提供新思路。

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[6] 李冬梅，李向培,等.强直性脊柱炎患者外周血CD4+CD25+CD127low- T细胞检测及其意义[J].中华临床免疫和变态反应杂志， 2008(4):266-271.

[7] Cardiel MH, Londoo JD, Gutiérrez E, et al.Translation, cross-cultural adaptation, and validation of the Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index (BASFI), the Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) and the Dougados Functional Index (DFI) in a Spanish speaking population with spondyloarthropathies. [J]Clin Exp Rheumatol， 2003(4):451.

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(2014-09-29收稿，2014-11-03修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 赵毅

·临床研究·

A Study on the Clinical Value and Correlation of Treg and Th17

Cells among Different Active Stages of Ankylosing Spondylitis

WANG Zuolong1， ZHONG Naifeng2， MA Li1

(1.CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Department

ofBiotechnology,SchoolofMedicalBioengineeringofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the clinical significance and correlation of T helper cells 17(Th17) and regulatory T cells(Treg) in different stages of patients with ankylosing spondylitis(AS) . Methods: A total of 78 peripheral blood samples were taken from AS patients，the AS group was divided into low-activity AS group and high-activity AS group, 30 healthy peripheral blood samples serves as control group. Th17 and Treg numbers were detected by flow cytometry(FCM ) and intracellular cytokine staining technique(ICS) to study the relationship between Treg, Th17 cells and AS activity. Results: Compared with the control group, the percentage of Treg cells in AS group and low-activity AS group had no significant difference (P>0.05), high-activity AS group peripheral blood Treg cells were significantly reduced(P<0.01).The percentage of Th17 cells in AS group increased(P<0.01), peripheral blood Th17 percentage of low-activity AS group and high-activity AS group were increased(P<0.05), and the ratios of Th17/Treg in AS group , low-activity AS group and high-activity AS group were increased(P<0.01).The ratio of Treg cells of high-activity AS group was significantly lower than that of low-activity AS group(P<0.01); the ratio of Th17 cell of high-activity AS group was significantly higher than that of low-activity AS group(P<0.01); the ratio of peripheral blood Th17/Treg cell of high-activity AS group was significantly higher than that of low-activity AS group(P<0.01). There were positive correlation of Bath ankylosing spondylitis disease activity index (BASDI) with peripheral blood Th17 cell ratio and Th17/Treg ratio of AS patients, negative correlation between BASDI and Treg cells ratio of AS patients(P<0.05). Conclusions: Changes of the amount of Treg and Th17 cells is related to the occurrence and development of AS. The amount of Treg and Th17 and the ratio of Th17/Treg can contribute to diagnose AS patient condition and serve as the treatment target of AS.

[Key words]T helper cells 17； regulatory T cells； spondylitis， ankylosing; immunity,cellular; autoimmune diseases

[中图分类号]R446.62

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0068-04

通信作者**E-mail:18608505639@163.com网络出版时间：2015-01-13

[基金项目]*贵州省科技厅社会发展攻关项目[黔科合LG字(2011)034号]