雌二醇对三阴乳腺癌细胞integrin β4水解作用的影响*



雌二醇对三阴乳腺癌细胞integrin β4水解作用的影响*

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1901.018.html

陈腾祥1， 严莉莎1, 霍建云1， 张金娟2， 潘娅1， 王晋星一1， 陈妮1， 臧贵勇3， 胡晓霞1

(1.贵阳医学院 生理学教研室， 贵州 贵阳550004； 2.贵阳医学院 机能学实验室， 贵州 贵阳550004； 3.贵阳医学院 人体解剖学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究三阴乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231细胞中雌二醇对整合素(integrin)β4水解的促进作用。方法: 常规培养MDA-MB-231细胞至指数增长期，分别给予17β-雌二醇、雌激素受体(ER)特异性阻断剂4-羟基他莫西芬(OHT)和G蛋白偶联受体30(GPR30)特异性阻断剂G-15干预30 min，采用蛋白质印迹(Western blot)实验检测钙激活中性蛋白酶 2(calpain 2)的表达和integrin β4水解的情况。 结果: 17β-estradiol在短时间内可促进MDA-MB-231细胞130 和95kD integrin β4水解片段的产生，促进作用呈浓度依赖方式，而对calpain 2表达没有明显影响；4-OHT不能阻断17β-estradiol对integrin β4的水解作用，且其本身可促进integrin β4水解；G-15能阻断17β-estradiol对integrin β4的水解。结论: 在TNBC MDA-MB-231细胞中，17β-estradiol可通过GPR30促进130和95kDintegrin β4水解片段的产生。

[关键词]三阴乳腺癌； 整合素β4; 钙激活中性蛋白酶 2； 17β-雌二醇； 4-羟基他莫西芬； G蛋白偶联受体30

The Proteolysis of Integrin β4 in Triple Negative Breast

整合素(integrin)β4与另外1个亚家族成员integrin α5形成二聚体，是构成半桥粒的重要组成部分，可使细胞锚定在基质膜上[1]。integrin β4不仅有黏附功能，也参与细胞信号转导[2]。研究发现，integrin β4可以被钙激活中性蛋白酶2(calpain 2)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)等蛋白酶水解，不同蛋白酶对其水解所产生的细胞行为变化不同[3-4]。本研究发现，在雌激素受体(estrogen receptor，ER)阴性的三阴乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)MDA-MB-231细胞中，17β-雌二醇 (17β-estradiol)可以促进integrin β4的水解，本课题对其可能机制进行研究。

1材料与方法

1.1试剂与设备

calpain-2 large subunit (M-type) antibody、integrin β4 antibody购于美国cell signaling technology公司，DMEM、胎牛血清(FBS)购于美国invitrogen公司，4-羟基他莫西芬(4-hydroxytamoxifen，OHT)、17β-estradiol、聚丙烯酰胺以及双甲叉丙烯酰胺购于美国sigma-aldrich公司，G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)特异性阻断剂G-15购于英国Tocris Bioscience公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。电泳仪及微型垂直电泳槽购于美国GE公司， GBOX iChemiXR化学发光及凝胶成像仪购于美国Syngene公司，倒置荧光显微镜购于奥林巴斯公司，高速冷冻离心机购于美国Beckman公司。

1.2MDA-MB-231细胞的培养

MDA-MB-231细胞株购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，于DMEM(高糖)培养液、37 ℃、10%FBS和5% CO2培养。

1.3实验方法

为了了解17β-estradiol是否可以促进MDA-MB-231乳腺癌细胞integrin β4的水解，实验用17β-estradiol处理MDA-MB-231乳腺癌细胞；为了解17β-estradiol是否是通过ER促进MDA-MB-231细胞integrin β4的水解，实验采用了ER的特异性阻断剂4-OHT进行干预；为了解17β-estradiol是否是通过GPR30促进MDA-MB-231细胞integrin β4的水解，实验采用GPR30特异性阻断剂G-15进行干预；上述实验干预时间为30 min。Western blot检测步骤如下：将MDA-MB-231细胞铺于6 cm培养皿，培养至指数增长期；用37℃ PBS快速洗涤后，加入预冷RIPA细胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl、 pH 7.5，1% NP40，0.5% Na Deoxycholate， 0.1% SDS，10% glycerol，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na Vanadate，1 mmol/L PMSF)，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4℃ 12 000 r/min离心30 min，上样行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，室温封闭1 h，4 ℃ I抗孵育过夜，室温II抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化学发光试剂，GBOX iChemiXR进行化学发光检测。每组Western blot实验重复3次。

2结果

2.117β-estradiol促进MDA-MB-231乳腺癌细胞integrin β4水解

17β-estradiol可以促进130和95 kD integrin β4水解片段产生，这种促进作用呈浓度依赖方式，在10-7 mol/L的浓度时，剪切作用最为明显；17β-estradiol没有使calpain 2的表达发生明显改变。见图1。

2.2ER阻断剂4-OHT不能阻断17β-estradiol对integrin β4的水解

OHT不能阻断17β-estradiol对integrin β4的水解，而且OHT单独作用30 min也可以促进130和95 kD integrin β4水解片段产生。17β-estradiol和OHT同时作用时，促进integrin β4水解的效应没有明显的叠加。见图2。

2.3GPR30阻断剂G15可阻断17β-estradiol对integrin β4的水解

G-15可阻断17β-estradiol对integrin β4的水解，G-15单独作用不能促进integrin β4的水解。见图3。

图2　ER阻断剂4-OHT对MDA-MB-231乳腺癌细胞integrin β4水解的影响Fig.2　The role of estrogen receptor (ER) blocker in the proteolysis of integrin β4 in MDA-MB-231 breast cancer cells

图3　G15对 MDA-MB-231细胞integrin β4水解的影响Fig.3　The role of GPR30 blocker in the proteolysis of integrin β4 in MDA-MB-231 breast cancer cells

3讨论

ER、妊激素受体(progesterone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)等3种受体阴性的乳腺癌细胞称为三阴乳腺癌(TNBC)。此型乳腺癌好发于年轻女性，肿瘤的侵袭力强，易发生转移，预后效果差，5年生存率不到5%[5]。由于ER、PR和HER2为阴性，所以针对这3种受体的阻断治疗无效，临床还缺乏相应的治疗指南，因此成为乳腺癌研究的难点和重点。MDA-MB-231属于三阴乳腺癌细胞，是研究三阴乳腺癌的重要工具细胞。本实验对MDA-MB-231细胞integrin β4的表达进行检测，发现其表达为阳性，而且在未受到其它因素干预的情况下，integrin β4的水解不明显。本实验给予雌激素(17β-estradiol)短时间处理，integrin β4的130 和95kD的水解片段明显增多。常见的integrin β4水解片段的分子量大小有200、130和95 kD。本课题组在ER和PR阳性的乳腺癌细胞中发现，200 kD的 integrin β4水解片段的产生与calpain 2的水解作用有关[6]；有研究报道，分子量大小约为95 kD的水解片段的产生可能与基质金属蛋白酶(MMP)有关[3]。这些结果和数据提示，17β-estradiol可能通过影响MMP和其它的水解酶导致MDA-MB-231细胞integrin β4的水解增加，而calpain 2可能不参与其中的作用。MDA-MB-231中ER阴性，因此17β-estradiol不太可能通过ER发挥作用，本实验采用ER受体阻断剂4-hydroxytamoxifen进行干预，结果发现4-hydroxytamoxifen不但不能阻断17β-estradiol促integrin β4水解的作用，其自身单独作用也可以促进integrin β4的水解。研究报道，雌激素的受体除了ERα和ERβ以外，还有GPR30，GPR30与ERα和ERβ没有同源型，主要定位于细胞质膜上，在MDA-MB-231细胞中，GPR30定位于内质网[7]。在ERα和ERβ阴性的组织细胞中，雌激素可通过GPR30发挥生物效应。4-hydroxytamoxifen对于ERα和ERβ是阻断剂，而对于GPR30则是激动剂。这些提示，17β-estradiol和4-hydroxytamoxifen都是通过GPR30促进integrin β4的水解。为了进一步确认，本实验采用GPR30特异性抑制剂G-15[8]进行干预，结果发现G-15能有效地阻断17β-estradiol对MDA-MB-231细胞integrin β4的水解促进作用，表明17β-estradiol是通过GPR30促进integrin β4的130 kD和95kD的水解片段产生，进而影响乳腺癌细胞的生物学行为。

参考文献4

[1] Dellambra E, Prislei S, Salvati AL, et al. Gene correction of integrin beta4-dependent pyloric atresia-junctional epidermolysis bullosa keratinocytes establishes a role for beta4 tyrosines 1422 and 1440 in hemidesmosome assembly[J]. J Biol Chem, 2001(44):41336-41342.

[2] Guo W, Pylayeva Y, Pepe A, et al. Beta 4 integrin amplifies ErbB2 signaling to promote mammary tumorigenesis[J]. Cell, 2006(3):489-502.

[3] Pal-Ghosh S, Blanco T, Tadvalkar G, et al. MMP9 cleavage of the beta4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice[J]. J Cell Sci, 2011(Pt 15):2666-2675.

[4] Werner ME, Chen F, Moyano JV, et al. Caspase proteolysis of the integrin beta4 subunit disrupts hemidesmosome assembly, promotes apoptosis, and inhibits cell migration[J].J Biol Chem, 2007(8):5560-5569.

[5] Poteca T, Comanescu M, Poteca A, et al. The many faces of triple negative breast cancer[J]. Chirurgia, 2014(4):471-479.

[6] 胡晓霞, 霍建云, 张金娟, 等. 钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响[J].贵阳医学院学报, 2015(1): 1-5.

[7] 罗浩军, 杨光伦, 涂刚雌. 激素受体GPR30研究进展[J].中国癌症杂志, 2009(11):881-886.

[8] Dennis MK, Burai R, Ramesh C, et al. In vivo effects of a GPR30 antagonist[J]. Nature Chemical Biology, 2009(6):421-427.

(2014-12-01收稿，2014-12-25修回)

Cancer Cell is Enhanced by Estradiol via GPR30

CHEN Tengxiang1, YAN Lisha1, HE Jianyun1，ZHANG Jinjuan2, PAN Ya1,

WANG Jingxingyi1, CHEN Ni1, ZANG Guiyang3, HU Xiaoxia1

(1.DepartmentofPhysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Functional

Laboratory,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofAnatomy,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the way of estrogen to enhance the proteolysis of integrin β4 in triple negative breast cancer (TNBC) cell, MDA-MB-231. Methods: MDA-MB-231 was treated with 17β-estradiol , 4-hydroxytamoxifen(OHT) and G-15 for 30 min respectively or jointly when the cell reached to exponential growth stage. Then, Western blot was used to detect the proteolysis of integrin β4 and the expression of calpain 2. Results: As Western blot results showing, not the expression of calpain 2, but the hydrolysis products of integrin β4 with molecular weight of 130 kD and 95kD were raised by 17β-estradiol in a short time with dose-dependent way. However, an estrogen receptor (ER) specific inhibitor could enhance, instead of block, the proteolysis function of 17β-estradiol to integrin β4, which could be blocked by the specific inhibitor of G-coupled protein receptor (GPR) 30, G-15. Conclusion: In TNBC cell, MDA-MB-231, the hydrolysis products of integrin β4 with 130 and 95 kD are enhanced by 17β-estradiol via GPR30.

[Key words]triple negative breast cancer; integrein β4；calcium-activated neutral proteases 2; 17β-estradiol; 4-hydroxytamoxifen; G-coupled protein receptor 30

[中图分类号]R737.9； R73-37

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0010-03

[基金项目]*国家自然科学基金资助项目(NO. 81060176);贵阳医学院院基金(院基金合同字第2012005号);贵州省高层次人才科研条件特助经费(TZJF-2009年38号)网络出版时间：2015-01-13