人脐带间充质干细胞致瘤性试验*



人脐带间充质干细胞致瘤性试验*

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20141205.1507.002.html

许键炜1,2， 何志旭1,3**， 舒莉萍1,4， 王凤昌1

(1.贵阳医学院 组织工程与干细胞实验中心， 贵州 贵阳550004； 2.贵阳医学院 药理学教研室， 贵州 贵阳550004； 3.贵阳医学院附院 儿科， 贵州 贵阳550004； 4.贵阳医学院 免疫学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察人脐带间充质干细胞对裸鼠的致瘤性。方法： 培养扩增人脐带来源的间充质干细胞，制备成细胞生理盐水混悬液注射裸鼠。观察8周裸鼠体内有无肿瘤生长。结果： 裸鼠注射细胞后无明显不适，8周观察期内裸鼠体内未见肿瘤生长，病理组织学检测未见异常。结论： 人脐带间充质干细胞导致肿瘤发生的可能性低。

[关键词]脐带； 间充质干细胞； 细胞，培养的； 小鼠,裸； 免疫组织化学； 致癌性试验

近年来，干细胞技术在生命科学领域得到越来越多的应用。利用干细胞修复受损组织可重建其功能，在肝硬化、类风湿性关节炎、糖尿病、脑瘫、脊髓损伤、骨折不愈合、视网膜色素变性等诸多疾病的治疗中疗效良好[1]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最初发现存在于骨髓中，目前已能从脐带、脐血和羊水中分离和制备[2]。MSCs具有免疫调控、造血支持、连续传代和冻存后仍有自我复制和多向分化潜能等特点，在特定的诱导条件下，可分化为多种组织细胞，可作为种子细胞用于组织器官损伤修复和抗衰老[3]。脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)因其增殖能力强、取材方便，在转化医学和组织工程中展现出广阔的应用前景[3]。但有关干细胞的安全性存在一定争议，有学者认为肿瘤源自干细胞[4]。因此，作为种子细胞的MSCs的安全性是临床前研究必须明确的基本问题。裸鼠由于其先天胸腺缺失，T、B淋巴细胞功能和胸腺依赖免疫功能完全缺乏，是致瘤实验的理想动物[5]。本试验旨在通过HUCMSCs对裸鼠的致瘤性试验，为临床使用HUCMSCs提供参考。

1材料与方法

1.1材料

新生儿脐带(贵阳仁爱医院妇产科提供)，胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone公司),无血清培养基(美国Gibco公司)，L-DMEM培养液(美国Gibco公司)，流式检测试剂盒(PE、APC、FITC、Cy5.5，美国BD公司)，CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)，倒置相差显微镜(日本PANASONIC公司)，流式细胞仪(MOFLO ，美国贝克曼库尔特公司)。Balb/c裸鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK、2009-0004)。

1.2方法

1.2.1HUCMSCs培养及鉴定无菌操作下采集符合条件(产妇年龄20~35岁，健康，无各种遗传、传染性疾病；胎儿足月，健康，体重超过2.5 kg)新生儿的10~15 cm长脐带一条，去除脐带动静脉血管和外膜层，取华尔通胶，剪刀剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，平铺接种于75 cm2培养瓶，加入含10% FBS的L-DMEM液10 mL，培养箱5% CO2，37 ℃饱和湿度培养，倒置相差显微镜观察，5 d后半换液，以后每4~5 d全换液，待细胞融合达50%以上去除华尔通胶，继续培养。细胞融合至80%~90%传第1代，之后加用含有生长因子的无血清培养基。传至第4代，应用流式细胞仪检测细胞膜表面分子CD90、CD44、CD105、CD73的表达。

1.2.2实验分组及观察参照《中华人民共和国药典》三部 (2010版)标准[6]，取8周龄，体重18~20 g的雌性Balb/c裸鼠10只。按随机数字表法分为对照组和实验组，每组5只。动物在具有独立通气笼盒( IVC) 的SPF级屏障系统条件下饲养。室温控制在26~28 ℃，相对湿度保持在40%~60%。标准饲养盒内喂养，每盒2~3只，每日照明12 h。 实验组裸鼠于单侧前、后腿内侧皮下分别接种培养至第4代的含HUCMSCs 1×109/L的细胞悬液0.5 mL。对照组同一部位注射等量生理盐水。观察裸鼠8周内有无瘤体生长及其他不良反应发生；于注射后第8周末处死裸鼠，并行常规组织病理学检查。

2结果

2.1HUCMSCs的培养、鉴定及收集

2.1.1细胞培养接种约1周可见细胞贴壁生长。接种2周左右细胞融合达50%，呈梭形、流水样生长分布；培养3周左右，细胞融合达80%~90%。加用含有生长因子的无血清培养基后，生长迅速。1传2，3~5 d可传下一代。见图1。

图1　培养至第4代的人脐带间充质干细胞(40×)Fig.1　HUCMSCs cultured to the fourth generation

2.1.2流式细胞鉴定流式细胞仪检测结果显示，培养至第4代的细胞，流式检测显示CD105+、CD90+、CD73+、CD44+，NOT-HUCMSCs-。见图2。

图2　HUCMSCs免疫表型Fig.2　The immunophenotype of HUCMSCs

2.1.3HUCMSCs收集细胞使用前弃培养液，生理盐水洗涤两遍后加入0.25%胰蛋白酶2 mL，置37 ℃培养箱消化3 min，等量L-DMEM液终止消化。吸管吹打使贴壁细胞游离，后收集入离心管800 r/min离心，生理盐水洗涤两遍重悬成细胞悬液备用。台盼蓝染色计数活细胞数达90%以上。

2.2裸鼠注射HUCMSCs后观察

8周观察期内裸鼠未见明显不良反应，无死亡。注射HUCMSCs悬液第8周末，经处死解剖未见瘤体形成。病理检查示正常组织结构，未见有集落形成及特殊病变。 见图3。

图3　裸鼠注射HUCMSCs部位病理学结果(HE，×40)Fig.3　Histopathologic findings on HUCMSCs injection site of nude mice

3讨论

MSCs具有分化形成多种成熟细胞的能力，特别是其跨胚层、跨系统的分化潜能，对多系统疾病的治疗、器官的重建以及损伤的修复有着重大的影响。HUCMSCs作为一类免疫缺陷细胞，异体移植免疫排斥反应弱，不同个体之间的移植，不需配型即可使用[9-10]。MSCs独特的生物学特征在再生医学中展现出诱人的应用前景，成为了研究的热点。 裸鼠具有免疫缺陷特点，异种移植时不产生排斥反应[5]，在裸鼠皮下接种已知可致瘤(或癌) 性细胞可生长成具有原发瘤组织形态、染色体组型及免疫特点的实体瘤[11-12]。因此，在药品、生物制品的安全性评价领域以及免疫、肿瘤研究中占据愈来愈重要的地位。

胚胎干细胞移植可形成多种畸胎瘤已被学界公认，Houghton等[13]报道骨髓源性干细胞移植可导致胃癌，Matsubara等[14]认为干细胞导致的新生血管可能形成血管瘤。本试验通过机械法分离、培养、扩增可获得大量HUCMSCs，将传至第4代的HUCMSCs进行流式细胞仪检测显示CD105+、CD90+、CD73+、CD44+，NOT-HUCMSCs-，符合MSCs的生物学特征[7-8]。将HUCMSCs移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下，细胞用量按公斤体重计，为临床通常用量的500倍。增加干细胞的移植数量，就会加大致瘤的风险[15]。但经8周后解剖学及病理组织学检查未发现异常。通过其对裸鼠的致瘤性研究，结果初步表明，经过短期传代培养的HUCMSCs不具有致瘤性，这与文献[16]报道相符。HUCMSCs容易获得，采集对产妇和新生儿均不会带来任何创伤和不良反应，且病原微生物感染及传播几率相对较低，亦不涉及法律和伦理方面的争议，是组织工程理想的种子细胞，实验结果初步表明其传代早期的细胞应用于临床是安全的。目前其临床应用尚处于起步阶段，有关HUCMSCs移植的适应症、 禁忌症、 并发症、 远期疗效和远期的安全性等问题仍需大量长期的实验及临床观察。

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(2014-10-10收稿，2014-11-25修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 赵毅

Tumorigenicity Test of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

XU Jianwei1,2， HE Zhixu1,3， SHU Liping1,4， WANG Fengchang1

(1.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

2.DepartmentofPharmacology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.Department

ofPediatrics,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

4.DepartmentofImmunology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate nude mice's tumorigenicity caused by human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs). Methods: Cultured and amplified HUCMSCs，and prepared into cell normal saline hypodermic injection used for injecting nude mice. Tumor growth condition was observed for eight weeks. Results: Mice had no obvious adverse reaction，8 weeks of tumorigenicity study showed that no tumor developed．Histopathologic examinations also showed no abnormality. Conclusions: The possibility of HUCMSCs lead to tumor growth is very low.

[Key words]umbilical cord; mesenchymal stem cells； cell, cultivated; mice, nude; immunohistochemistry; tumorigenicity test

[中图分类号]R73-35

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0017-03

通信作者**E-mail:hzx@gmc.edu.cn网络出版时间：2014-11-27

[基金项目]*国家自然科学基金资助项目(No.30560159)；贵州省“125计划”重大科技专项[黔教合重大专项字(2013020) ]；贵州省教育厅自然科学研究项目[黔教合KY字(2012036)]