钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响*



钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响*

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1906.020.html

胡晓霞1, 霍建云1， 张金娟2， 潘娅1， 王晋星一1， 陈妮1， 张祥令3， 陈腾祥1**

(1.贵阳医学院 生理学教研室, 贵州 贵阳550004； 2.贵阳医学院 机能学实验室, 贵州 贵阳550004; 3.贵阳医学院 组织胚胎学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察乳腺癌细胞系MCF7细胞中，钙激活中性蛋白酶2(calpain-2)对整合素(integrin)β4水解的影响。方法: 利用“短发夹”RNA(shRNA)和微小RNA(mirRNA)技术结合的calpain-2基因沉默(gene silencing)慢病毒质粒(GIPZ lentiviral shRNAmir)转染乳腺癌细胞株MCF7，嘌呤霉素筛选稳定沉默calpain-2基因的细胞株，细胞株传4代，用荧光显微镜观察转染效率，用蛋白质印迹(Western blot)实验检测calpain-2基因沉默效率及integrin β4水解的情况。结果: 嘌呤霉素筛选、细胞传4代，荧光显微镜下观察显示转染和筛选后，EGFP表达阳性的MCF7细胞的比例分别达到(95.6±2.6)%(空shRNAmir 载体)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir 1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2)，差异无统计学意义(P>0.05)；Western blot结果显示，基因沉默的MCF7细胞中calpain-2的表达被明显抑制，相对于空shRNAmir 载体转染的MCF7细胞，差异有统计学意义(P<0.01)，calpain-2的表达下调到21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2)，空shRNAmir 载体转染的MCF7细胞中calpain-2的表达与未转染的MCF7细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05)；比较calpain-2基因沉默和空shRNAmir载体转染的MCF7细胞，发现integrin β4均被水解，水解片段的分子量主要有200 kD、130和95 kD；calpain-2基因沉默后，calpain-2基因沉默MCF7细胞中200 kD的水解片段比空shRNAmir载体转染的MCF7细胞减少(P<0.01)。结论: 在乳腺癌细胞MCF7中，calpain-2可能参与integrin β4的200 kD片段的形成，从而参与调整integrin β4的构象变化。

[关键词]乳腺肿瘤； 钙激活中性蛋白酶 2； 整合素β4; 蛋白水解； 基因沉默

Research on the Effect of Calpain-2 on the Proteolysis

整合素(integrin)β4是整合素亚家族成员之一，整合素属细胞表面的黏附分子，构成细胞与细胞外基质及细胞之间的联系。在上皮细胞膜表面，integrin β4与另外1个亚家族成员integrin α5形成二聚体，作为一个功能单元与网格蛋白(plectin)、大天疱疮抗原2(bullous pemphigoid antigen 2，BPAG2)以及大天疱疮抗原1e(BPAG1e)构成半桥粒(hemidesmosomes)，半桥粒与细胞外基质中的laminin 5结合，使细胞锚定在基质膜(basement membrane)上[1]。有研究发现，当细胞膜上的半桥粒被解体，细胞就会与基质膜解离，失去锚定，而且通过信号转导，导致细胞间的连接解体，使细胞游离出来，成为可以转移的细胞[2]。在这些过程中，integrin β4扮演着重要的角色，integrin β4胞内Ser1424位点的磷酸化是调控半桥粒的解体的重要步骤，而蛋白质相应位点的磷酸化通常需要蛋白质发生构象的改变。蛋白质剪切修饰是改变蛋白质构象和功能的主要方式之一[3]。有研究报道integrin家族成员可以被水解成小片段，而钙激活中性蛋白酶(calpain)是integrin的水解酶之一[4-5]。目前尚未清楚calpain对integrinβ4的水解形式。本课题拟通过基因沉默下调calpain-2在MCF7细胞中的表达，检测integrinβ4被水解的情况，从而了解calpain-2对integrinβ4的水解影响。

1材料与方法

1.1药物和试剂

“短发夹”RNA(short hairpin RNA，shRNA)mir慢病毒(lentiviral)质粒和菌株购于美国Open Biosystems公司，calpain-2 large subunit (M-type) antibody、integrin β4 antibody购于美国cell signaling technology公司，DMEM、胎牛血清(FBS)购于美国invitrogen公司，聚丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺购于美国sigma-aldrich公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2主要仪器及设备

电泳仪及微型垂直电泳槽购于美国GE公司， GBOX iChemiXR化学发光及凝胶成像仪购于美国Syngene公司，倒置荧光显微镜购于奥林巴斯公司，高速冷冻离心机购于美国Beckman公司。

1.3细胞培养及基因沉默

MCF7细胞株购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，于DMEM培养液、37 ℃、10%FBS和5% CO2培养。分别用shRNAmir lentiviral空载体GIPZ质粒(vecter)、含calpain-2基因(GenBank登录号NM-001748)沉默核酸片段(Calpain-2 shRNA1为CCC TTG GCA GGG AAT ATT T，Calpain-2 shRNA2为GCC AAG ATA TCA AGT CAG A为美国Open Biosystems公司设计合成)的GIPZ lentiviral转染MCF7细胞，用2 mg/L嘌呤霉素进行逐代筛选，于荧光显微镜下和激光共聚焦扫描显微镜下观察报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表达情况。用图像分析软件Image-Pro Plus6.0进行细胞计数分析，每个转染细胞的培养皿中观察6个视野，计算细胞数的均数及shRNAmir lentiviral质粒转染效率。

1.4calpain-2基因沉默效率及integrin β4水解的情况

采用Western blot方法检测calpain-2基因沉默效率及integrin β4水解的情况。将细胞铺6 cm培养皿，扩大培养至80%的细胞满度，洗涤后加入预冷RIPA细胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1% NP40，0.5% Na Deoxycholate， 0.1% SDS，10% glycerol，137 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na Vanadate，1 mmol/L PMSF)，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，上样行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，室温封闭1 h，4 ℃ I抗孵育过夜，室温II抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化学发光试剂，GBOX iChemiXR进行化学发光检测。用图像分析软件对目的蛋白进行灰度定量，除于内参灰度，计算相对灰度值(relative gray scale)。每组Western blot实验重复3次。

1.5统计学方法

利用SPSS 16.0对细胞数均值、Western blot蛋白质条带相对灰度值均数进行t检验。P<0.01为差异有统计学意义。

2结果

2.1shRNAmir lentiviral质粒转染效率

通过荧光显微镜观察发现，shRNAmir lentiviral空载体GIPZ质粒(vecter)、含calpain-2基因沉默shRNAmir片段的GIPZ lentiviral质粒(calpain-2 shRNAmir1、calpain-2 shRNAmir2)转染的MCF7细胞均有报告基因EGFP表达(图1A)。利用嘌呤霉素进行筛选，未含质粒抗性基因的细胞逐渐凋亡，表达质粒基因或shRNAmir片段的细胞比例增加，筛选到第4代后，EGFP表达阳性的MCF7细胞的比例分别达到(95.6±2.6)%(空shRNAmir 载体)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir 1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2)，差异无统计学意义(P>0.05)(图1B),表明空载体质粒和含基因沉默片段的质粒的细胞转染效率没有差异。2.2calpain-2 shRNAmir 对MCF7细胞calpain-2的基因沉默效果

注：A图为质粒转染细胞后48 h EGFP的表达，BF为激光共聚焦显微镜明场视野下的观察，Merge为相应的EGFP和BF观察图的叠加；B图为嘌呤霉素筛选后表达EGFP的细胞数，P1、P2、P3和P4分别为筛选细胞的传代数图1　shRNAmir GIPZ lentiviral质粒转染MCF7后筛选的效果Fig.1　The effect of transfection by shRNAmir GIPZ lentiviral plasmid after puromycin screening

(1)与未转染与空shRNAmir载体MCF7比较，P<0.01图2　MCF-7细胞中Calpain-2的表达(Western blot)Fig.2　The expression of calpain-2 in the stably transfected MCF-7 cells

通过Western blot实验检测发现，基因沉默的MCF7细胞中calpain-2的表达被明显抑制，相对于空shRNAmir 载体转染的MCF7细胞，calpain-2的表达下调至21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2)，差异有统计学意义(P<0.01)，空shRNAmir 载体转染的MCF7细胞中calpain-2的表达与未转染的MCF7细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。2.3calpain-2基因沉默MCF7细胞中integrin β4的水解模式

如图3，MCF7细胞中integrin β4未被水解的原始片段大小约为210 kD，被水解的小分子片段，主要片段的分子量大小约为200、130和95 kD。calpain-2基因沉默MCF7细胞中200 kD的水解片段比空shRNAmir载体转染的MCF7细胞减少(P<0.01)。

图3　MCF-7细胞中integrin β4的水解模式(Western blot)Fig.3　The effect of calpain-2 gene silence on the proteolysis of integrin β4 in MCF7 cell

3讨论

基因沉默是指基因在转录和翻译时受到阻碍，导致表达下调和缺失，从而丧失其蛋白质所执行的功能。在实验室中，通过非编码RNA分子(non-coding RNA)的干扰(RNA interference，RNAi)来沉默基因是目前的主要手段。在非编码RNA中，微小RNA(microRNA, miRNA)是最主要的干扰片段。miRNA含有18~25个氨基酸，根据碱基互补配对原则与靶mRNA结合形成沉默复合物，影响mRNA的稳定性或阻遏mRNA的翻译。内源性的miRNA的前体是含茎环结构的shRNA，在Dicer酶的降解作用下，产生miRNA。本研究采用的基因沉默技术方法称为shRNAmir技术，设计的RNA片段含有shRNA，在两侧还分别有miRNA片段，这些片段重组构建在lentiviral载体上，可以转染或感染细胞后，可以在细胞内降解产生数量较多的miRNA，比较高效地沉默靶mRNA[6]。在本研究中，针对calpain-2设计的shRNAmir lentiviral载体及未含靶基因shRNAmir的空载体对细胞的转染效率是相同的，但是针对靶基因calpain-2的2个shRNAmir(Calpain-2 shRNAmir 1和Calpain-2 shRNAmir 2)具有很好的基因沉默效率，使MCF7细胞的calpain-2的表达下调了80%。

Calpain是由钙离子激活的中性蛋白酶，最常见的有calpain-1和calpian-2，calpain-1可被微摩尔级浓度的钙离子激活，而calpain-2则需要毫摩尔级浓度的钙离子才能激活[7]。本研究发现，calpain-2的基因沉默引起integrin β4 的降解模式发生了改变。在乳腺癌细胞MCF7中，完整的integrin β4的分子量为210 kD。本研究检测发现integrin β4有水解片段，水解片段的分子量大小约为200、130和95 kD， calpain-2的基因沉默后，integrin β4的200 kD水解片段明显减少，表明integrin β4有限水解成为200 kD的蛋白分子与calpain-2有关。Integrin可以被一些蛋白酶水解修饰，从而导致结构的改变。有研究发现，integrin β4可以被多种水解酶降解，其中基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinases 9, MMP9) 可以水解integrin calpain-2的细胞外段，使得胞浆中产生大约100 kD的片段，使得半桥粒解体，使细胞与基质脱离[8]。Werner ME[9]发现caspase-3和caspase-7 则可以对integrin β4的胞内段进行水解，导致半桥粒不能组装，诱使上皮细胞凋亡；Potts AJ[4]发现，calpain可以将integrin β4水解为205、165和125 kD的片段；Giancotti FG[5]发现calpain可以将integrin β4水解为165 和130 kD的片段。但是，这些实验还未解析calpain-2在其中所扮演的角色，在肿瘤细胞中，钙离子的波动较大，使得calpain-2在肿瘤细胞的活动中扮演了重要的角色[10]。有研究发现，calpain-2可以促进癌细胞的浸润[7]。因此，搞清楚calpain-2对integrin β4的水解作用，有利于理解期对半桥粒的影响和肿瘤的浸润能力的作用机制。本研究表明，calpain-2可能参与integrin β4的200 kD片段的形成，从而参与调整integrin β4的构象变化。

参考文献4

[1] Dellambra E, Prislei S, Salvati AL, et al. Gene correction of integrin beta4-dependent pyloric atresia-junctional epidermolysis bullosa keratinocytes establishes a role for beta4 tyrosines 1422 and 1440 in hemidesmosome assembly[J]. J Biol Chem, 2001(44):41336-41342.

[2] Guo W, Pylayeva Y, Pepe A, et al. Beta 4 integrin amplifies ErbB2 signaling to promote mammary tumorigenesis[J]. Cell, 2006(3):489-502.

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[4] Potts AJ, Croall DE，Hemler ME. Proteolytic cleavage of the integrin beta 4 subunit[J]. Exp Cell Res, 1994(1):2-9.

[5] Giancotti FG, Stepp MA, Suzuki S, et al. Proteolytic processing of endogenous and recombinant beta 4 integrin subunit[J]. J Cell Biol, 1992(4):951-959.

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[7] Storr SJ, Carragher NO, Frame MC, et al. The calpain system and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2011(5):364-374.

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[9] Werner ME, Chen F, Moyano JV, et al. Caspase proteolysis of the integrin beta4 subunit disrupts hemidesmosome assembly, promotes apoptosis, and inhibits cell migration[J].J Biol Chem, 2007(8):5560-5569.

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(2014-12-08收稿，2014-12-28修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 周凌

·专题研究·

of Integrin β4 in MCF7 Cell

HU Xiaoxia1, HE Jianyun1， ZHANG Jinjuan2, PAN Ya1, WANG Jingxingyi1,

CHEN Ni1, ZHANG Xiangling3, CHEN Tengxiang1

(1.DepartmentofPhysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.FunctionalLaboratory,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofHistologyandEmbryology,

GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the effect of calcium-activated neutral proteases 2(calpain-2) on proteolysis of integrin β4 in breast cancer cell line, MCF7. Methods: Plasmids of GIPZ lentiviral shRNAmir combined with shRNA and microRNA (miRNA) technology were transfected into MCF7 cells to silence the expression of calpain-2. The puromycin was used to screen MCF7 with 4 passages to acquire the stable calpain-2-silenced cell lines. The transfected rates were evaluated with immunofluorecence method under microscope, and efficiency of calpain-2 silencing and integrin β4 proteolysis condition were detected with Western blot. Results: As immunofluorescence microscope result showing, the ratios of the cells expressing green fluorescence protein (GFP) were (95.6±2.6)%(empty shRNAmir), (97.1±1.7)%(calpain-2 shRNAmir 1)and(97.7±0.2)%(calpain-2 shRNAmir 2), without statistic diversity (P>0.05) . The expression of calpain-2 had no distinctive diversity (P>0.05) in empty shRNAmir transfected MCF7 cells and in control, while was decreased to 21.5%, 18.8% in calpain-2 shRNAmir 1 and 2 transfected cells respectively V.S. control (P<0.01). In MCF7 cell, integrin β4 were cut into low molecular weight (LMW) fragment as 200 kD, 130 kD and 95 kD. However, in calpain-2 silenced MCF7 cell, 200 kD fragments were decreased. Conclusion: Formation of 200 kD fragments of integrin β4 is associated with calpain-2.

[Key words]breast neoplasms; calcium-activated neutral proteases 2; integrein β4； proteolysis; gene silencing

[中图分类号]R737.9； R73-37

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0001-05

通信作者**E-mail:gzctxin@qq.com网络出版时间：2015-01-13

[基金项目]*国家自然科学基金资助项目(NO. 81060176)；贵州省科技厅自然 [黔科合J字(2008)2280]；贵阳市科技局社会发展公关计划项目[筑科农字(2010)1号]