甘草干姜汤治疗变应性鼻炎大鼠的实验研究*



甘草干姜汤治疗变应性鼻炎大鼠的实验研究*

***贵阳医学院临床医学院2011级本科学生网络出版时间：2015-01-13

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1915.023.html

张燕平1， 吴宁2**， 王炜妍1， 王时敏2***

(1.贵阳中医学院第二附属医院， 贵州 贵阳550003； 2.贵阳医学院 生物化学与分子生物学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 观察甘草干姜汤对变应性鼻炎大鼠外周血中γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)的表达及鼻黏膜组织的影响。方法： 120只大鼠随机分为正常组、甘草干姜汤组、模型组及西药组4组，后3组用卵清蛋白(AVO)制作变应性鼻炎动物模型，分别给予甘草干姜汤2~2.5 mL/只、西替利嗪溶液2~2.5 mL/只、生理盐水2~2.5 mL/只灌胃(模型组及对照组)，每天1次；每组大鼠分别在灌胃10、20及30 d时处死10只，检测大鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，同时观察各组大鼠各时点的行为学和鼻黏膜组织学变化。结果： 灌胃10 d，甘草干姜汤组和西药组与模型组大鼠行为学表现无明显差异(P>0.05)，但与正常组存在明显差异(P<0.01)；灌胃20 d，甘草干姜汤组和西药组大鼠与模型组和正常组均有明显的差异(P<0.01)；灌胃30 d，甘草干姜汤组和西药组行为学变化接近正常组(P>0.05)；甘草干姜汤组和西药组灌胃10和20 d 时，血清中IFN-γ、IL-4水平与正常组、模型组均有明显差异(P<0.01)；灌胃30 d，甘草干姜汤组、西药组IFN-γ和IL-4与模型组比较，分别有明显升高和下降(P<0.01)，但与正常组无明显差异(P>0.05)；HE染色示甘草干姜汤组与西药组灌胃30 d，鼻黏膜结构逐渐修复，嗜酸细胞显著减少，而正常组与模型组未见明显改变。结论： 甘草干姜汤能改善变应性鼻炎大鼠的症状，对鼻黏膜有一定修复作用，其机制可能与调节IFN-γ-及IL-4水平有关。

[关键词]鼻炎，变应性； 白细胞介素4； γ-干扰素； 鼻粘膜； 甘草干姜汤

变应性鼻炎又称过敏性鼻炎，是由于易感个体接触致敏变应原后导致的多种免疫活性细胞、细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症性疾病，临床以频繁发作的喷嚏，过量的鼻水样分泌物等症状为主要特征，是耳鼻咽喉头颈外科常见多发病及难治性疾病[1]。现代医学提出一些改善变应性鼻炎症状的治疗手段，但对远期疗效还缺乏满意的治疗方法和手段，且费用高，药物副作用大，治疗手段要求高，患者坚持系统治疗的依从性不高。中医药对治疗变应性鼻炎有独特优势，但缺乏对其治疗机理的科学依据。甘草干姜汤是张仲景的经方，具有温中复阳，培土生金之功，全方药味精简，理方甚深，临床用甘草干姜汤煎水口服可明显减轻变应性鼻炎症状[2]，为探究其治疗机理，本研究采用甘草干姜汤治疗变应性鼻炎动物模型，总结如下。

1材料与方法

1.1材料与试剂

健康清洁级SD大鼠120只，体重180~220 g，雌雄各半，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，合格证号SCXK(渝)2007-005。参照实验动物与人临床用药剂量体重换算的转换公式计算，将甘草干姜汤(甘草30 g、干姜15 g)按原方剂量要求在蒸馏水煎汁后用生理盐水配成浓度相当于生药0.384 g/mL煎液[3]。西替利嗪(宜昌长江药业有限公司提供，批号20120314)，10 mg/片，用生理盐水配制成0.05%溶液。卵清白蛋白(OVA，sigma产品，A5503-1G)；氢氧化铝[AL(OH)3]、ELISA法血清试剂、白细胞介素-4(IL-4)含量测定试剂盒、干扰素-γ(IFN-γ)含量测定试剂盒，由上海巧伊生物科技有限公司提供，批号JER-03、JER-06。

1.2实验方法

1.2.1造模参照章如新[4]、Konno A[5]变应性鼻炎动物模型制作方法并改进：将120只大鼠，常规饲养1周后，随机选90只采用卵清蛋白致敏的方法造模，用配好的含[OVA 0.3 mg+AL(OH)3凝胶30 mg]的变应原混悬液每鼠1 mL腹腔注射，隔日1次，共7次，为基础致敏。腹腔注射完成后，每只大鼠以0.25%OVA生理盐水溶液2 mL雾化吸入强化致敏，每日1 次，连续5 d。间歇3 d后，用5%OVA生理盐水攻击双侧鼻腔，每侧50 μL，每日1次，共7次。剩余30只大鼠用相应等量的生理盐水腹腔注射、雾化和滴鼻攻击。

1.2.2动物分组致敏后的90只大鼠随机分为甘草干姜汤组、模型组和西药组，各30只；剩余30只为正常组。甘草干姜汤组和西药组分别给予甘草干姜汤和西替利嗪溶液2~2.5 mL/只，其余两组给予2~2.5 mL/只的生理盐水灌胃，每天1次；给药期间，甘草干姜汤组、西药组和模型组每日仍以1%OVA滴鼻维持致敏，正常组以生理盐水滴鼻，每日1次，每次20 μL，直至给药结束。各组大鼠分别在灌胃10、20、30 d时处死10只。

1.2.3行为学观察参照1997年(海口)修订的全国变应性鼻炎诊断及疗效评定标准：从给药开始，观察大鼠的喷嚏、抓鼻和流涕情况，观察时间为鼻腔滴药(给予1%OVA，每侧50 μL)30 min内，采用叠加量化记分法对大鼠进行行为学指标评分[6]。(1)喷嚏：1次连续3～9个为1分，10～14个为2分，≥15个为3分。(2)鼻痒：轻搔鼻2～3次为1分，3～5次为2分，5次以上为3分。(3)流涕：流至鼻孔为1分，超过前鼻孔为2分，涕流满面为3分。叠加总分≥5分表示制造模型成功。

1.2.4外周血IL-4、INF-γ测定大鼠末次给药24 h内，股动脉放血取血，分离血清，采用定量ELISA 法检测血清IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.5鼻黏膜组织取材大鼠处死后，剥除上颌骨部皮肤，将上颌骨从颅骨中游离出来，沿鼻中线切开，暴露鼻中隔及双侧鼻腔，取鼻黏膜组织。将部分鼻中隔前部黏膜固定于10%甲醛溶液中，脱水，石蜡包埋，常规切片4 μm厚，HE染色，光镜下观察组织形态学改变。

1.3统计学方法

2结果

2.1行为学表现

模型组、甘草干姜汤组和西药组全部动物叠加记分均>5分，出现典型的变应性鼻炎症状，频繁的喷嚏，搔抓鼻周围，大量清涕流出及觅食减少等行为学表现；正常组动物偶有轻微喷嚏和搔抓鼻部的症状，但叠加记分均<5；模型组、甘草干姜汤组和西药组3组大鼠变应性鼻炎造模成功。灌胃10 d，甘草干姜汤组与西药组大鼠仍有的喷嚏、挠鼻、流清涕表现，与模型组大鼠行为学表现无明显差异(P>0.05)，但与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。甘草干姜汤组与西药组给药20 d后，症状明显好转，喷嚏、挠鼻次数较前明显减轻，鼻部症状未完全恢复，仍有变应性鼻炎症状表现，与模型组与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；甘草干姜汤组与西药组治疗30 d后，鼻部症状与正常组大鼠差异无统计学意义(P>0.05)，但与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠干预后的行为学指标

(1)与正常组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P>0.05；(3)与正常组比较，P<0.01；(4)与模型组比较，P<0.01；(5)与正常组比较，P>0.05；(6)与模型组比较，P<0.01

2.2血清IFN-γ、IL-4

甘草干姜汤组和西药组给药10、20 d时，与模型组比较，血清IFN-γ水平明显升高，IL-4水平明显下降(P<0.01)；用药30 d时，与模型组比较，甘草干姜汤组和西药组IFN-γ明显升高，IL-4明显下降(P<0.01)，但甘草干姜汤组和西药组IFN-γ、IL-4与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3大鼠鼻黏膜变化

图1显示，正常组大鼠鼻粘膜上皮细胞无增生，排列整齐，杯状细胞少，固有层无水肿；模型组大鼠鼻粘膜上皮增厚，杯状细胞增生，固有层水肿，嗜酸细胞浸润，腺体增生；甘草干姜汤组10 d时，鼻粘膜纤毛排列不整齐，上皮细胞增生，嗜酸细胞浸润；甘草干姜汤组20 d时，上皮细胞逐渐变薄，嗜酸细胞浸润变少；甘草干姜汤组30 d时，鼻粘膜纤毛排列整齐，上皮细胞逐渐恢复正常，仅有少量的嗜酸细胞存在；西药组10 d时，上皮细胞增生，嗜酸细胞浸润；西药组20 d时，上皮细胞变薄，嗜酸细胞浸润变少；西药组30 d时，纤毛整齐，上皮细胞逐渐恢复正常，嗜酸细胞减少。

表2　各组大鼠干预后血清IFN-γ、IL-4水平

(1)与正常组比较，P<0.01；(2)与模型组比较，P<0.01；(3)与正常组比较，P<0.01；(4)与模型组组比较，P<0.01；(5)与正常组比较，P>0.05；(6)与模型组比较，P<0.01

图1　各组大鼠干预后鼻黏膜病理学观察(HE,×400)Fig.1　The pathological changes of nasal mucosa of rats in each group after medication

3讨论

变应性鼻炎时患者体内T淋巴细胞亚群的失衡，尤其是Th1/Th2细胞在数量、活化及功能方面的比例失衡是其发病机制中的重要环节，是导致鼻黏膜慢性炎症和组织损伤的重要因素[7]。IL-4是Th2细胞释放的关键性细胞因子，对Th2细胞极化有重要的诱导作用，并可抑制Th1细胞的增殖[8]。IFN-γ为Th1细胞的标志性细胞因子，可抑制Th2细胞的增殖活化，减少IL-4的产生，并拮抗IL-4的各种生物学效应，阻止IgE的合成[9]。

本实验结果证实甘草干姜汤有改善变应性鼻炎的症状，对变应性鼻炎细胞因子失衡方面有一定的调节作用，作用机制可能是甘草干姜汤可纠正失衡的Th1/Th2细胞因子网络,使变应性鼻炎大鼠血清中的IFN-γ水平升高、IL-4水平降低，从而使体内Th细胞分化偏移发生逆转,促使Th1/Th2分泌的细胞因子比值恢复平衡，从而抑制并改善变应性鼻炎临床症状。本实验结果提示变应性鼻炎大鼠在服用甘草干姜汤治疗20~30 d有效，为临床上服用甘草干姜汤治疗变应性鼻炎提供有效的用药周期。通过观察病理切片HE染色大鼠鼻粘膜组织结构的改变及炎症因子数量变化，说明甘草干姜汤有一定修复鼻粘膜组织损伤的作用，有利于炎症的消除。本实验结果初步探讨甘草干姜汤治疗变应性鼻炎的作用机制，为甘草干姜汤合理运用于临床提供了一定的实验理论支持。

参考文献4

[1] 顾之燕,董震.变应性鼻炎的诊治原则和推荐方案(2004 年,兰州)[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2005(3)：166-167.

[2] 张燕平.运用甘草干姜汤的临床点滴体会[J]. 中国中医药现代远程教育, 2011(18):62.

[3] 陈奇.中药药理研究方法学[M]. 北京:人民卫生出版社， 2006:1168，1180.

[4] 章如新,江德胜,李兆基,等.P物质能神经阻滞剂治疗变应性鼻炎的实验研究[ J ] .中华耳鼻咽喉科杂志, 1994(5):282-285.

[5] Konno A,Terada N,Okamoto Y.changes of adrenergic andmuscarinic cholinergic recePtors in nasal mucosa in nasal allergy[J].ORL, 1987(49):103.

[6] 中华医学会耳鼻咽喉科分会，中华耳鼻咽喉科杂志编委会.变应性鼻炎诊断标准及疗效评定标准[J].中华耳鼻咽喉科杂志， 1998(3)：134-135.

[7] 熊瑛, 章诗富, 成丽兰,等. 滨蒿内酯治疗变应性鼻炎的实验研究[J]. 贵阳医学院学报, 2011(5):452-459.

[8] 张明,赵利敏.Th2细胞的极化[J].山东大学基础医学院学报, 2003(6):369.

[9] 赵义造,黄益灯,黄加云.针刺对变应性鼻炎大鼠IL-4、IFN-γ水平影响的研究[J].福建中医药, 2010(5):52-53.

(2014-09-03收稿，2014-10-23修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 周凌

Experimental Study on the Role of Licorice and Dried Ginger

in Treating Rats with Allergic Rhinitis

ZHANG Yanping1, WU Ning2, WANG Weiyan1, WANG Shimin2

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550003,Guizhou,China;

2.DepartmentofBiochemistryandMolecularbiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China

[Abstract]Objective: To observe the impact of licorice and dried ginger on peripheral blood levels of γ-interferon (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) as well as nasal tissue of allergic rhinitis rats. Methods: A total of 120 rats were randomly divided into four groups: the normal control group (group C), licorice and dried ginger group (group L), model group (group M), and western medicine control group (group W). Rats in the latter three groups were given ovalbumin (OVA) to establish allergic rhinitis model and were given licorice and dried ginger soup, physiological saline and cetirizine by gavage respectively. On the 10th, 20thand 30thday after administration, 10 rats were sacrificed respectively, and serum levels of IFN-γ, IL-4 were detected, changes of rat behavior and nasal mucosa tissues in each time point were observed. Results: On the 10thday after medication, there was no significant difference in rat behavior among groups L, M and W (P>0.05), while significant difference was found between the three groups and group C (P<0.01). On the 20thday after medication, there were significant differences in rat behavior and serum levels of IFN-γ, IL-4 between groups L, W and groups C, M (P<0.01). On the 30th day after medication, rat behavior and serum levels of IFN-γ, IL-4 in groups L and W were close to group C (P>0.05), and the structure of nasal mucosa gradually repaired, eosinophils significantly reduced in groups L and W. Conclusions: Licorice and dried ginger can improve the symptoms of allergic rhinitis rat and repair the nasal mucosa. The mechanism may relate to regulate the serum levels of IFN-γ and IL-4.

[Key words]rhinitis,allergic; interleukin-4; γ-interferon; nasal mucosa; licorice and dried ginger

[中图分类号]R34; R765.21

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0036-05

通信作者**E-mail:Zhang＿ypdjl@sina.com

[基金项目]*贵州省科技厅项目[黔科合中药字(2011)LKZ7012号]