贵州凤冈富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠Trx含量及肝脏超微结构的影响*



贵州凤冈富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠Trx含量及肝脏超微结构的影响*

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1921.026.html

申雪慧子1， 姬晓云2, 岳兰2， 刘华1， 吴宁1，3**

(1.贵阳医学院 生物化学与分子生物学教研室， 贵州 贵阳550004； 2.贵阳医学院 药学院， 贵州 贵阳550004； 3.贵阳医学院 理化实验中心， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究贵州凤冈富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠硫氧还原蛋白(Trx)含量及肝脏超微结构的影响，探讨富锌富硒绿茶保肝抗衰老的机制。方法： 昆明雄性小鼠70只均分为正常对照组、衰老模型组、阳性对照组、富锌富硒绿茶高、中、低剂量组和普通绿茶组，除正常对照组给予腹腔注射生理盐水外，其余6组均给予腹腔注射0.2 mg/(g·d)D-半乳糖制备衰老模型；造模第3周正常对照组和衰老模型组均给予蒸馏水灌胃，其余5组分别给予维生素C，高、中、低3种浓度富锌富硒绿茶及普通绿茶灌胃，1次/d，连续4周；最后1次灌胃后2 h取小鼠眼眶血，酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清Trx的含量，电镜下观察小鼠肝脏组织的超微结构。结果： 与正常对照组相比，衰老模型组Trx含量明显降低(P<0.01)，说明造模成功；与衰老模型组相比，富锌富硒绿茶组及普通绿茶组Trx含量升高(P<0.01，P<0.05)；与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组Trx含量升高(P<0.05)，说明富锌富锌绿茶抗氧化作用强于普通绿茶；富锌富硒绿茶高剂量组Trx含量高于中、低剂量组，中剂量组高于低剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)；电镜结果示衰老模型组肝细胞体积缩小，细胞核和细胞器损伤严重；富锌富硒绿茶组肝细胞体积正常，细胞核和细胞器接近正常；普通绿茶组肝细胞胞质内部分线粒体肿胀，内质网轻度扩张；阳性对照组胞质内线粒体及内质网结构接近正常，胞浆轻微肿胀疏松，肝细胞核形态基本接近正常细胞核。结论： 贵州凤冈富锌富硒绿茶能明显增加衰老模型小鼠血清Trx含量，具有延缓衰老的作用。

[关键词]小鼠； 细胞结构； 硫氧还蛋白； 衰老模型；富锌富硒绿茶

衰老是生物随着时间的推移而表现出的机能退行性变[1]。虽不可违背，但可以延缓[2]。肝脏是研究机体衰老的重要器官，其衰老主要表现在超微结构的改变。硫氧还原蛋白(Trx)参与了机体的氧化还原反应，能减轻氧化应激反应导致的细胞损伤[3]。有研究报道，贵州富锌富硒绿茶中所含有的天然物质成分对延缓衰老、杀菌、消炎等均有特殊效果[4]。本研究以腹腔注射D-半乳糖制备的衰老模型小鼠为研究对象，观察贵州凤冈富锌富硒绿茶对衰老小鼠血清中Trx含量的变化及肝脏超微结构的改变，探讨凤冈富锌富硒绿茶保肝抗衰老的机制。

1材料及方法

1.1材料

昆明雄性小鼠70只，体重18~25 g，购自贵阳医学院动物中心[SCXK(贵)2007-004]。富硒富锌绿茶由贵州凤冈县永安镇田坝村生产，D-半乳糖(上海恒信化学试剂厂)，TRX ELISA (E03T0336，上海蓝基生物科技有限公司)，透射电子显微镜(日本，HITACHI7650),酶标仪(北京新风，ZS-3型)，台式高速冷冻离心机(湘仪贝克，TGL-20M)，37 ℃恒温箱(天津泰斯特，202-2AB)。

1.2方法

1.2.1分组及造模70只小鼠适应喂养3 d，随机均分为7组，正常对照组、衰老模型组、阳性对照组、富锌富硒绿茶(高、中、低)组及普通绿茶组。正常对照组给予腹腔注射0.9%生理盐水(0.01 mL/g)，其他各组腹腔注射D-半乳糖0.2 mg/(g·d)，连续6周复制小鼠衰老模型[5-6]，造模第3周正常对照组和衰老模型组均给予蒸馏水灌胃，其余5组分别给予维生素C(1 g/L)，高、中、低3种浓度富锌富硒绿茶及普通绿茶灌胃，1次/d，连续4周。富锌富硒绿茶按0.1 g/mL沸水冲泡30 min，过滤即为高浓度绿茶，对倍稀释为中浓度绿茶，再次对倍稀释即为低浓度绿茶；普通绿茶按0.1 g/mL沸水冲泡30 min即可。

1.2.2观察指标最后1次灌胃后2 h处死小鼠，取眼眶血分离血清，用ELISA方法检测Trx含量，电镜观察小鼠肝脏超微结构[7]。小鼠肝脏超微结构观察：取小鼠肝脏组织约1 mm3，4%戊二醛磷酸缓冲溶液固定， EPON-812环氧树脂包埋、切片、甲苯胺蓝染色、光镜下定位、超薄切片、透射电子显微镜观察。

1.3统计学处理

2结果

2.1血清Trx水平

与正常对照组相比，衰老模型组Trx含量明显降低(P<0.01)，表明造模成功；与衰老模型组相比，富锌富硒绿茶组及普通绿茶组Trx含量均升高，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，提示绿茶均有抗氧化作用；与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组除低剂量组外Trx含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明富锌富锌绿茶抗氧化作用强于普通绿茶；富锌富硒绿茶高剂量组Trx含量高于中、低剂量组，中剂量组高于低剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组小鼠血清Trx含量

(1)与正常对照组相比,P<0.01；与衰老模型组相比,(2)P<0.01，(3)P<0.05；(4)与普通绿茶组相比,P<0.05

2.2小鼠肝超微结构

电镜显示正常对照组肝细胞核呈椭圆形，核膜平整光滑，无变形，细胞质内有丰富的线粒体，线粒体内外膜及线粒体嵴较完整清晰可见，粗面内质网有丰富核糖体附着(图1-A)。衰老模型组肝细胞核体积较正常略有缩小且不规则，细胞核染色质浓缩，电子密度增加，厚薄不均，细胞核异染色质增多，染色加深；细胞质内线粒体、内质网数量明显减少，并有少量脂滴，可见细胞质内线粒体肿胀，粗面内质网扩张，并有轻度脱颗粒现象(图1-B)。富锌富硒绿茶高剂量(图1-C)与阳性对照组(图1-G)胞质内线粒体及内质网结构接近正常，胞浆轻微肿胀疏松，肝细胞核形态基本接近正常细胞核。富锌富硒绿茶中剂量组肝细胞胞质内部分内质网轻度扩张，细胞核染色质较均匀分布，余细胞质中细胞器无明显变化(图1-D)。富锌富硒绿茶低剂量(图1-E)和普通绿茶组(图1-F)肝细胞胞质内部分线粒体肿胀，内质网轻度扩张。

A为正常对照组，B为衰老模型组，C、D、E分别为富锌富硒绿茶高、中、低剂量组， F为普通绿茶组，G为阳性对照组图1　各组小鼠肝组织电镜下超微结构Fig.1　EM pictures of liver tissue ultrastructure of mice in different groups

3讨论

Trx是一类分布广泛的小分子多功能蛋白，它的抗氧化作用是清除过氧化氢，也是GSH-PX的有效电子传递体，还能将被氧化的过氧化氢酶还原成单体[8]。硫氧还原蛋白还原酶(TrxR)是一种NADPH依赖的包含黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，分为TrxR-1～3，可催化NADPH 将Trx上的-S2还原成(-SH)2的反应，维持Trx的还原型[3]。TrxR每个单体都含有1个调节氧化还原活性的二硫化物和1个FAD；TrxR在NADPH 的参与下调节多种底物的还原反应，在氧化还原调节和抗氧化防御中起重要的作用，TrxR和还原型TRX形成了一个有效的蛋白还原系统，具有重要的抗氧化损伤作用[9]，Trx功能如果受到抑制，就会导致氧化还原失衡，最终引起细胞凋亡[10]。本实验中ELISA的实验结果显示与正常对照组相比，衰老模型组Trx含量明显降低(P<0.01)，与本课题组前期研究抗氧化损伤指标一致[7]，表明该指标亦可用于鉴定衰老模型造模是否成功。本研究还发现，富锌富硒绿茶组及普通绿茶组Trx含量均高于衰老模型组 (P<0.01，P<0.05)，说明绿茶有抗氧化损伤作用；而富锌富硒绿茶组Trx含量高于普通绿茶组 (P<0.05)，证实了富锌富锌绿茶抗氧化作用强于普通绿茶；但在富锌富硒绿茶，虽然高剂量组Trx含量高于中、低剂量组，中剂量组高于低剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

肝脏是机体物质代谢的关键器官，肝细胞的损伤和凋亡是机体衰老的重要标志[11]。线粒体作为细胞内能量合成的主要场所，产生的ATP是细胞内的主要能量来源，其性状改变与衰老过程密切相关。有研究报道，随着年龄的增长，多种组织中线粒体功能都出现了衰退、包括线粒体数量的减少[12]。此外，内质网中的粗面内质网是细胞中合成蛋白质的主要场所，表面附着大量核糖体颗粒，细胞核内的遗传信息被带到这里进行“翻译”而合成蛋白质。其数量及形态的改变标志着细胞衰老、损伤的程度[13]。本研究电镜观察结果显示，衰老模型组肝脏超微结构出现了明显异常改变，主要表现为细胞核染色质浓缩，体积相对缩小，细胞质内线粒体肿胀，内质网数量明显减少。而富锌富硒绿茶低剂量和普通绿茶组肝细胞胞质内部分线粒体肿胀，内质网轻度扩张，富锌富硒绿茶中剂量组肝脏超微结构明显改善，高剂量组肝细胞结构基本恢复正常水平。说明贵州凤冈富锌富硒绿茶能明显抑制衰老小鼠肝脏组织中细胞器的衰老、损伤改变，可能通过抗氧化机制发挥延缓衰老作用。

综上所述，富锌富硒绿茶能明显增加衰老模型小鼠血清Trx含量，并抑制衰老导致的小鼠肝组织超微结构的异常变化，具有延缓衰老的作用。

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(2014-10-22收稿，2014-11-12修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 刘华

·基础研究·

Influences of Green Tea with Rich Zn and Se from Fenggang County, Guizhou

Province on Trx Content and Liver Ultrastructure of Aging Model Mice

SHENXUE Huizi1, JU Xiaoyun2, YUE Lan2, LIU Hua1, WU Ning1,3

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

2.SchoolofPharmacy,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.ExperimentCenterof

PhysicsandChemistry,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the effect of Fenggang tea with rich Zn and Se on thioredoxin (Trx) content and liver ultrastructure of D-galactose-induced aging mice and to explore the mechanism of protecting liver and anti-aging of the tea. Methods: Seventy Kunming male mice (15~18 g) were randomly divided into control group, positive control group (Vitamin C), high, middle and low dose groups of zinc-rich and selenium-rich green tea (RZS tea groups), ordinary green tea group, and aging model group. Except control group, mice in all groups received intraperitoneal injection of 0.2 mg/(g·d) D-galactose to become aging mice model. In 3 weeks after model construction, RZS tea groups received intragastric administration of preset high, middle and low doses of zinc-rich and selenium-rich green tea. While positive control group, and ordinary green tea group received intragastric administration of Vitamin C and ordinary green tea respectively, and control group and aging model group received the same amount of saline. All intragastric administrations lasted four consecutive weeks, once per day. In 2 hours after the last administration, the orbital blood was taken for detection of Trx content by ELISA, and liver ultrastructure of mice was examined by electron microscope. Results: Compared with the control group, serum Trx content of aging model obviously decreased (P<0.01), which indicated the model was built successfully. Serum Trx contents in RZS tea groups were obviously higher than those of aging model group (P<0.01，P<0.05). Compared with ordinary green tea group, Trx content increased in RZS tea groups, showing the anti-oxidation effect of RZS tea was higher than that of ordinary tea. Among RZS tea groups Trx content in high dose group was higher than that in middle and low dose groups, but the differences were not significant (P>0.05). In aging model group, the volume of liver cells decreased. The cell nucleus and organelle of liver cell was seriously injuried. On the contrary, in RZS tea groups, the volume of liver cells was normal. The shape of cell nucleus and organelle of liver cell were close to that of normal control group. In ordinary green tea group, part of mitochondria in liver cytoplasm swelled and the endoplasmic reticulu expanded slightly. In positive control group, the structure of mitochondria and endoplasmic reticulu of liver cells was close to normal, and cytoplasm swelled and loosen slightly. The shape of liver cell nuclei was close to that of normal liver cell. Conclusions: Zinc-rich and selenium-rich green tea from Fenggang can increase serum Trx content in aging mice model and has some effects of anti-aging.

[Key words]mice; cellular structures; thioredoxin; aging model; green tea with rich Zn and Se

[中图分类号]R151

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)01-0013-04

通信作者**E-mail:1638210715@qq.com网络出版时间：2015-01-13

[基金项目]*国家自然科学 (81260417)；贵州省科学技术基金[黔科合J字(2010)2216号，黔科合LG(2012)019号]