Logistic回归和ROC曲线评价生物标志物组对大动脉粥样硬化性脑梗死的诊断价值

吴丹红　李　华　李　晨　蒋筠斐　钟　萍

201999　上海交通大学医学院附属第三人民医院神经内科(吴丹红　李　华　李　晨)；上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科(蒋筠斐)；上海中医药大学附属上海市中西医结合医院脑病科[钟　萍(通信作者)]



Logistic回归和ROC曲线评价生物标志物组对大动脉粥样硬化性脑梗死的诊断价值

吴丹红李华李晨蒋筠斐钟萍

201999上海交通大学医学院附属第三人民医院神经内科(吴丹红李华李晨)；上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科(蒋筠斐)；上海中医药大学附属上海市中西医结合医院脑病科[钟萍(通信作者)]

目前在缺血性脑卒中急性期仍然缺乏一种广泛应用、快速和敏感的诊断实验。在一些其他医学急症，基于血液生物标志物的诊断实验已经成为常规。如肌钙蛋白、肌酸激酶、脑钠肽、D-二聚体在急性心肌梗死、心力衰竭、肺栓塞的早期诊断中发挥重要作用。既往有研究表明，多种血液生物学标志物(超敏C反应蛋白、脂蛋白相关磷脂酶A2、金属基质蛋白酶-9等)水平在缺血性脑卒中急性期有不同程度的升高[1-3]，但是单一标志物的变化对缺血性脑卒中的诊断具有一定的局限性。在我国TOAST病因分型中的大动脉粥样硬化性脑梗死是重要的亚型，因此本研究筛选与大动脉粥样硬化性脑梗死相关的6项血液生物标志物形成生物标志物组[脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated Phospholipase A2，Lp-PLA2)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、金属基质蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)、超敏C反应蛋白(Hypersensitive C-reactive protein，Hs-CRP)、纤维蛋白原(Fibrinogen, FIB)、脑钠肽(Brain natriuretic peptide，BNP)]，应用Logistic回归分析与ROC曲线对其进行综合评价，以探讨生物标志物组对大动脉粥样硬化性脑梗死急性期的诊断价值。

1资料与方法

1.1临床资料随机选取2011年1月～2012年12月在上海交通大学医学院附属第三人民医院神经内科住院的大动脉粥样硬化性脑梗死急性期患者88例，均为发病后48h内入院。所有病例均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》诊断标准[4]，并经头颅MRI检查证实，经TOAST分型[5]为大动脉粥样硬化性脑梗死。另设对照组88例，为同期来院就诊的头痛头晕患者，年龄、性别与病例组匹配，临床症状和头颅MRI检查均不支持急性缺血性卒中诊断。所有病例均排除脑血管畸形、急慢性心、肝、肾功不全、心律失常、恶性肿瘤、外伤、甲状腺疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病和结缔组织病等疾病。

1.2方法对大动脉粥样硬化性脑梗死患者(发病至采血时间均<48 h)和对照者入院当天仔细询问病史(起病时间、诱因、起病形式、病程进展等)，并进行详细的体格检查，记录患者的年龄、性别、既往病史包括高血压病、糖尿病、吸烟、饮酒史，同时记录患者本次的发病时间。

1.2.1标本采集所有研究对象均于入院次日清晨6时静息状态下抽取空腹肘静脉血8 mL置于3个真空采血管内:2 mL用EDTA-K2抗凝，即刻送检，进行Hs-CRP及BNP水平检测；2 mL用1∶9枸橼酸钠抗凝，以3000 r/min离心10 min后得到乏血小板血浆，进行FIB水平检测；采血4 mL后30 min内于2～8 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离上层血清，保存于-80 ℃冰箱保存备用，避免反复冻融，用于后续Lp-PLA2 、MMP-9、MPO水平检测。

1.2.2生物标志物组水平检测Hs-CRP：使用QUICKREAD GO反射比浊仪及配套试剂，反射比浊法检测；BNP：使用BIOSITE免疫荧光仪及配套试剂，免疫荧光法检测；FIB：使用SYSMEX CA-7000血凝仪及仪器配套试剂盒，免疫比浊法检测。以上三个检验项目由本院检验科完成。Lp-PLA2、MMP-9、MPO：使用eBioscience公司试剂，整个实验过程均严格参照试剂说明书要求进行。Lp-PLA2、MMP-9、MPO均采用ELISA双抗体夹心法检测，在终止反映后30 min内分别在波长540 nm、450 nm的酶标仪上读取数值，绘制标准曲线，根据标准品的浓度及对应的吸光度(A)值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

2结果

2.12组临床资料及生物标志物的比较

符合纳入标准的大动脉粥样硬化性脑梗死急性期患者88例，其中男63例，女25例，年龄46～81岁，平均年龄(63.45±12.12)岁。对照组为同期入院非脑卒中患者88例，其中男54例，女34例，年龄44～80岁，平均年龄(63.15±12.23)岁。2组比较年龄(P=0.867)及性别(P=0.152)差异不明显。病例组高血压病发生率高于对照组(P<0.05)，病例组与对照组的糖尿病、吸烟、饮酒史发生率差异不明显(P>0.05)(表1)。病例组Lp-PLA2、MPO、MMP-9、hs-CRP、FIB、BNP水平均明显高于对照组(P<0.05)(表2)。

表1　病例组与对照组一般危险因素比较

表2　病例组与对照组生物学标志物比较

2.26种生物标志物的Logistic回归分析

Logistic回归分析显示，6种生物标志物中与大动脉粥样硬化性脑梗死急性期的诊断呈正相关的是Lp-PLA2、MPO 、MMP-9、BNP(P<0.05)，而CRP、FIB的相关性则不明显(P>0.05)(表3)。

表3　6种生物标志物的Logistic回归分析

2.3ROC曲线分析4种生物标志物单独及联合检测对大动脉粥样硬化性脑梗死急性期的诊断价值

4种生物标志物单独检测的曲线下面积(AUC )BNP>Lp-PLA>MMP-9>MPO，最大为0.813，联合检测(新变量Y)的AUC为0.901(表4及图1)。

表4　单一生物标志物和联合检测新变量

图1 新变量Y和4种生物标志物的ROC曲线

3讨论

缺血性脑卒中是由于向大脑提供血液和营养物质的血管阻塞而突然发作的一种病理状态，早期确诊是采取合适治疗措施的重要依据。目前，缺血性脑卒中的早期诊断主要依靠临床评估及影像学评价，大多根据临床疑似脑卒中症状结合CT排除颅内出血进行诊断，存在一定的局限性。一些非脑卒中疾病也可能出现类似脑卒中的神经功能缺损症状。CT对缺血性脑卒中敏感性低，在发病早期经常是正常的，即使在发病后期小病灶及后颅窝病灶往往仍不能显示。MRI对缺血性脑卒中的敏感性更高，但在大多数医院发病早期不能立即应用，许多医院没有MRI设备。因此，临床需要一种快速、准确、便捷、低成本的检测手段作为目前诊断方法的补充。

缺血性脑卒中后伴随脑损伤及机体对脑卒中的应答，大量的分子释放入血。兴奋性神经传递、炎症反应、血栓形成和其他一些生理过程都能使这些分子从受损的神经元和胶质细胞释放出来。既往研究表明，多种血液生物学标志物与缺血性脑卒中尤其是动脉粥样硬化性脑梗死有关。LP-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成分泌，作为一种新型炎症标志物，参与了动脉粥样斑块形成的发生、发展、不稳定性及破裂的各个阶段，导致并加速动脉粥样硬化的发生、发展。鹿特丹(Rotterdam)前瞻性病例队列研究发现LP-PLA2与脑梗死的发病密切相关[6]。动脉粥样硬化社区(ARIC)研究显示，Lp-PLA2水平在缺血性脑卒中患者中升高[1]。我们前期的研究也表明，LP-PLA2参与大动脉粥样硬化性脑梗死的病理生理过程[7]。MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶。MPO能通过产生自由基和多种反应性物质，促进动脉粥样斑块形成和不稳定性增加，加速动脉粥样硬化进展，进而引起多种血管事件。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心脑血管疾病的危险性明显下降，MPO水平的升高可以预测血管事件的危险性[8-9]。MMP-9是一种属于金属蛋白酶家族的明胶酶，能消化细胞外基质并降解基底膜成分。MMP-9作为一种炎症反应因子可在多种病理条件下被激活，如动脉粥样硬化、多发性硬化、肿瘤生长和转移。在脑卒中动物模型中MMP-9的表达与血脑屏障破坏、水肿形成和出血性转化显著相关。在脑卒中模型和临床脑卒中患者均观察到MMP-9水平升高[10-11]。Hs-CRP是一种急性时相反应蛋白，主要由炎性介质刺激肝细胞分泌，是炎症和组织损伤时的非特异性敏感的炎症标志物。其在正常人血清中含量极微，而当机体存在动脉粥样硬化性病变时血CRP水平明显升高。研究表明Hs-CRP与缺血性脑卒中的发生有关[12-13]。BNP主要由心房心室肌细胞合成，在中枢神经系统亦广泛分布。以往研究提示BNP 可以作为诊断心力衰竭的敏感性指标，近来发现BNP也具有预测动脉粥样硬化危险性的意义。临床研究发现急性缺血性脑卒中患者血清BNP水平升高，且升高的程度与脑梗死病情轻重及预后相关[14]。FIB是由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是一种急性时相蛋白，参与凝血和血小板聚集，和动脉粥样斑块形成关系密切。研究发现升高的FIB水平与缺血性脑卒中风险增加和不良预后相关[15-16]。 本研究结果亦显示病例组血Lp-PLA2、MPO 、MMP-9、hs-CRP、FIB、BNP水平较对照组明显升高。

但是由于脑细胞的异质性、脑缺血级联反应的复杂性以及血脑屏障的存在，目前没有一种生物标记物可以单独用于缺血性脑卒中的临床诊断[17]。在急性心肌梗死的诊断中虽然肌钙蛋白I及其复合物在心肌组织中具有较高的特异性，但是其在血液中出现的时间相对于肌红蛋白这个具有较低特异性但高度敏感性的生物标志物显得滞后。因此，由肌红蛋白、肌钙蛋白I及其复合物、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶形成的生物标志物组对急性心肌梗死的诊断具有了较高的敏感性。正是这种基于血清生物标志物组的评估广泛应用于心肌梗死诊断，为急性缺血性脑卒中的诊断实验提供了新的思路。本研究选用与动脉粥样硬化性脑梗死相关的生物标志物Lp-PLA2、MPO 、MMP-9、hs-CRP、FIB、BNP，其中Lp-PLA2、MPO 、MMP9、CRP与动脉粥样硬化炎症机制有密切的关系，MMP9、BNP与脑梗死血脑屏障破坏有关，FIB与凝血纤溶相关。本研究将这些生物学标志物进行组合形成生物标志物组(Lp-PLA2、MPO 、MMP9、CRP、FIB、BNP)，进行Logeistic回归分析显示，Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP与大动脉粥样硬化性脑梗死呈正相关(P<0.05)。

受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)目前已成为广泛应用于临床诊疗和人群筛检研究中，其能将某种检测的灵敏度及特异性联系起来，是一种全面的、科学的评价检测项目的方法。ROC曲线越向左上偏，曲线下的面积越大，其识别能力也就是临床准确性就越优秀，其临床诊断价值越大。本研究通过多变量Logistic回归分析筛选出与大动脉粥样硬化性脑梗死密切相关的生物标志物Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP，并产生新变量Y。通过绘制ROC曲线得到新变量Y诊断的ROC曲线下面积为0.901,新变量Y值比任何单一指标的面积要大(Lp-PLA2:0.778;MPO:0.667;MMP9:0.720;BNP:0.813)。可见，通过检测标记物组可以将大动脉粥样硬化性脑梗死诊断的特异性和敏感性都提高到90%以上。多变量模型ROC曲线下面积达到0.901，对诊断大动脉粥样硬化性脑梗死有较高的敏感性和特异性。

本研究结果表明，多种生物标志物联合检测是提高缺血性脑卒中诊断试验临床价值的有效手段。但由于脑卒中的病程复杂性及脑组织结构的特殊性，脑卒中生物标志物的敏感性及特异性一直是脑卒中生物标志物研究所面临的主要问题。对于具有临床应用潜能的候选生物标志物还需要经过反复的临床验证，以达到为解决临床实际问题服务的最终目的。

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17Daniel TL, Scott EK, Jeffrey S, et al. Clinical usefulness of biomarker-based diagnostic test for acute stroke. Stroke, 2009,40(1)：77-85.

(2015-02-12收稿)

【摘要】目的评估生物标志物组对大动脉粥样硬化性脑梗死的诊断价值。方法88例大动脉粥样硬化性脑梗死患者和88例对照者入选本研究，分别检验脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、髓过氧化物酶(MPO)、金属基质蛋白酶-9(MMP-9)、超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、纤维蛋白原(FIB)、脑钠肽(BNP)，应用Logistic回归和ROC曲线分析生物标志物组对大动脉粥样硬化性脑梗死的诊断价值。结果Logistic回归显示Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP与诊断大动脉粥样硬化性脑梗死呈正相关(P<0.05)，多变量模型ROC曲线下面积达到0.901。结论生物标志物组(Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP)对大动脉粥样硬化性脑梗死急性期的诊断提供了重要的价值。

【关键词】大动脉粥样硬化性脑梗死脂蛋白相关磷脂酶A2髓过氧化物酶金属基质蛋白酶-9脑钠肽

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2015.04.004

The diagnostic value of a biomarker panel for large artery atherosclerotic stroke with Logistic regression and ROC curveWuDanhong，LiHua，LiChen，etal.DepartmentofNeurology，ShanghaiThirdPeople’sHospital,Schoolofmedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity，Shanghai201999

【Abstract】ObjectiveThe diagnosis of acute ischemic stroke is limited by the lack of a widely available, rapid, and sensitive diagnostic test. The purpose of the current study was to observe blood biomarkers levels of patients with acute large artery atherosclerotic stroke, and assess whether a test using a panel of biomarkers might provide useful diagnostic information in the early evaluation of stoke.Methods88 patients with acute large artery atherosclerotic stroke and 88 patients without acute ischemic stroke were enrolled. Blood samples were assayed for lipoprotein-associated Phospholipase A2(Lp-PLA2), myeloperoxidase(MPO), matrix Metalloproteinase-9(MMP-9), hypersensitive C-reactive protein, fibrinogen(Hs-CRP),and brain natriuretic peptide(BNP).The logistic regression and ROC curve were used to evaluate the diagnostic value of a biomarker panel for large artery atherosclerotic stroke.ResultsThe logistic regression model demonstrated that a diagnostic test incorporating the value of Lp-PLA2, MPO, MMP9 and BNP into a composite score was sensitive for large artery atherosclerotic stroke. The area under the ROC curve was 0.901.Conclusionsthese results suggest that a biomarker panel(Lp-PLA2、MPO 、MMP9、BNP)may add important diagnostic information in the early evaluation of large artery atherosclerotic stroke.

【Key words】Large artery atherosclerotic strokeLipoprotein-associated Phospholipase A2MyeloperoxidaseMatrix Metalloproteinase-9Brain natriuretic peptide

【中图分类号】R743

【文献标识码】A

【文章编号】1007-0478(2015)04-0207-04

基金项目：上海市卫计委科研课题(项目编号为201440332和2012-460)；上海市科委引导项目(项目编号为14411972000)