16种中草药提取物的抗氧化活性研究

王雪梅,吴汉平,汪晓敏,刘　洋,王家恒

(安徽大学 化学化工学院, 安徽 合肥　230601)



16种中草药提取物的抗氧化活性研究

王雪梅,吴汉平,汪晓敏,刘洋,王家恒

(安徽大学 化学化工学院, 安徽 合肥230601)

摘要:以无水乙醇、50%乙醇水溶液和水为提取剂,分别超声提取16种中草药,并运用3种抗氧化活性评价方法对各提取液的体外抗氧化能力进行了测定和评价．结果表明:红景天、何首乌、肉苁蓉的乙醇提取液对DPPH·、·OH和·O2-自由基都具有较强的清除能力;石榴皮的无水乙醇、50%乙醇水溶液和水3种提取液对DPPH·和·O2-自由基具有较强的清除能力;陈皮、丹参的水提取液对DPPH·和·O2-自由基也具有较强的清除能力;所有中草药的水提取液对·OH自由基的抑制率均较低．

关键词:中草药;自由基;抗氧化性;清除能力

生物有机体在代谢过程中不断地产生自由基,根据氧化性质及程度的不同,自由基一般被分为氧自由基、脂类自由基和半醌类自由基,与生命现象关系最为密切的是活性氧自由基,包括超氧阴离子自由基(·O2-)、羟基自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)、三线态氧(3O2)等．其中·O2-是生物体生成的第1个自由基,是所有自由基的前身,具有重要的生物功能,也与多种疾病有着密切关系;·OH是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基[1]．当生物有机体产生的自由基超出机体防护系统所具有的清除能力时,就会直接或间接地引起蛋白质变性、酶失活、DNA链断裂、细胞解体乃至机体病变或死亡[2-4]．自由基及其诱导的氧化作用被认为是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病等的重要因素[5-6]．

抗氧化剂能有效清除自由基,延缓人体衰老和预防疾病．天然抗氧化剂因其具有无毒副作用、无污染、无残留、安全等优点日益受到人们的关注．我国的中草药资源十分丰富,中草药中多含有黄酮、多酚、鞣质、皂苷及生物碱等活性成分,是很有潜力的天然抗氧化剂资源[7-9]．从中草药中筛选出具有抗氧化活性、清除自由基的物质是目前抗氧化研究领域较为重要的工作．由于中草药中往往含有多种抗氧化活性成分,而不同的萃取溶剂、方法和条件会导致评价效果的差异．因此,采用单一的抗氧化活性评价方法进行筛选不能全面反映中草药的抗氧化活性[10]．

作者选择以无水乙醇、50%乙醇水溶液和水作为提取溶剂,分别超声提取16种中草药,采用分光光度法测定提取物对DPPH·、·O2-、·OH 3种自由基的清除能力,以期较为全面地评价各中草药的抗氧化性．

1实验部分

1.1　试剂与仪器

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、水杨酸、硫酸亚铁、30%双氧水、抗坏血酸(VC)、无水乙醇,均为分析纯．红景天(RhodiolaroseaL.)、红花(CarthamustinctoriusL.)、何首乌(Polygonummultiflorum)、陈皮(CitrusaurantiumL.)、丹参(SalviamiltiorrhizaBge. )、当归(Angelicasinensis)、黄精(PolygonatumsibiricunRed.)、灵芝(Ganodermalucidum)、山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)、石榴皮(PunicagranatumL.)、绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)、银耳(Tremellafuciformis)、黄芪(Astragalusmembranaceus)、肉苁蓉(HerbaCistanches)、淮山药(DioscoreaoppositaThunb.)、玉竹(Polygonatumodoratum)，均购自合肥百姓缘大药房．蒸馏水,实验室自制．

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1.2　实验方法

1.2.1　中草药提取液的制备

准确称取经干燥、粉粹后的各类中草药1.0 g,采用无水乙醇、50%乙醇水溶液和水作为提取剂进行提取．分别加入40 mL提取剂,超声30 min后过滤;向滤渣中再加入40 mL该提取剂,继续超声30 min过滤,合并两次滤液,将滤液定容至100 mL后,按1∶10稀释得各中草药待测液,待测液中药液浓度为1 mg·mL-1．

1.2.2　各种中草药的抗氧化能力测定

(1) 对DPPH·自由基的抑制率[11]

分别取中草药待测液和浓度为2.00×10-4mol·L-1的DPPH·乙醇溶液各3 mL加入同一具塞试管中,摇匀,在室温暗处放置30 min后,以蒸馏水为参比,用紫外-可见分光光度计测定混合溶液在517 nm处的吸光度(Ai1),同法测定3 mL的各提取剂与3 mL DPPH·溶液混合后的吸光度(A01)和3 mL样品溶液与3 mL无水乙醇混合后的吸光度(Aj1),根据下列公式计算抑制率(S1)

S1=[1-(Ai1-Aj1)/A01]×100%．

(2) 对·OH自由基的抑制率[12]

分别取浓度为1.00×10-2mol·L-1的水杨酸-乙醇溶液、浓度为1.00×10-2mol·L-1的FeSO4溶液和中草药待测液各2 mL加入同一具塞试管中,然后加入2 mL 8.8×10-2mol·L-1的H2O2溶液,摇匀,于37 ℃水浴中反应30 min后,以蒸馏水为参比,在510 nm处测定吸光度(Ai2);以2 mL去离子水代替水杨酸溶液测定吸光度(Aj2);用2 mL提取剂代替上述待测液来测定吸光度(A02)．根据下列公式计算抑制率(S2)

S2=[1-(Ai2-Aj2)/A02]×100%．

(3) 对·O2-自由基的抑制率[13]

取pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液5 mL于具塞试管中,在25 ℃水浴中预热20 min后,依次加入待测液2 mL和0.5 mL浓度为5.00×10-3mol·L-1邻苯三酚溶液(用1.0×10-2mol·L-1的HCl溶液配制),摇匀,于25 ℃水浴中反应4 min,以1.0×10-2mol·L-1的HCl溶液作参比,在320 nm处测定其吸光度(Ai3);以该浓度的HCl溶液0.5 mL代替邻苯三酚溶液,测定吸光度(Aj3);用各提取剂2 mL代替上述不同待测液,测定吸光度(A03)．根据公式计算抑制率(S3)

S3=[1-(Ai3-Aj3)/A03]×100%．

用同样方法测定质量浓度为1 mg·mL-1的VC水溶液对DPPH·、·OH、·O2-3种自由基的抑制率．

(4) IC50的测定

用上述同样方法测定提取物、VC在不同浓度下的抑制率,以提取物的浓度为横坐标,以抑制率为纵坐标作图,在图中找出抑制率为50%时的提取物溶液浓度IC50．

2结果与讨论

2.1　对DPPH·自由基的清除能力分析

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基,具有单一电子,能够接受一个电子或氢离子,在波长517 nm处具有最大吸收,其醇溶液呈深紫色．当有抗氧化剂存在时,DPPH·的单电子被捕捉而使其颜色变浅,在最大吸收波长处的吸光度值会下降,且下降程度呈线性关系,可用于评价实验样品的抗氧化能力．此抗氧化能力用抑制率来表示,抑制率越大,其抗氧化性越强[14]．

16种中草药提取液对 DPPH·的抑制率测定结果见表1．

表1　16种中草药提取液对DPPH·的抑制率

由表1可以看出,16种中草药提取液对DPPH·自由基都具有一定的清除能力．其中红景天、何首乌、石榴皮、肉苁蓉、山楂的无水乙醇提取液对DPPH·自由基的抑制率均在88%以上;红景天、何首乌、石榴皮、肉苁蓉、山楂、丹参、陈皮的50%乙醇提取液对DPPH·自由基的抑制率超过了75%;陈皮、丹参、石榴皮、红景天的水提取液对DPPH·自由基的抑制率也均达到了70%．VC对DPPH·自由基的抑制率为81.7%．从表1中可以看出:多数中草药的无水乙醇提取液对DPPH·自由基的抑制率高于其水提取液,而陈皮、丹参的水提取液对DPPH·自由基的抑制率却远高于其醇提取液．

对表1中前8种中草药的提取液及VC进行浓度梯度稀释,分别测定其对DPPH·的抑制率,并计算IC50,其值见表2．IC50是指对自由基的抑制率为50%时的提取物溶液浓度,IC50越小,抗氧化能力越强．

表2　几种中草药提取液对DPPH·的半抑制率浓度

由表2可见,VC的IC50(0.046 mg·mL-1)最小;中草药中IC50较小的依次为红景天的无水乙醇提取液(0.065 mg·mL-1)和50%乙醇提取液(0.072 mg·mL-1)、石榴皮的无水乙醇提取液(0.092 mg·mL-1)和50%乙醇提取液(0.101 mg·mL-1)、陈皮水提取液(0.113 mg·mL-1)、丹参水提取液(0.132 mg·mL-1)等,说明其对DPPH·自由基的清除作用均较强．

2.2　对·OH自由基的清除能力分析

·OH是生物体内最活泼的活性氧,也是已知的对生物分子破坏能力最强的自由基之一．通过利用Fenton反应,Fe2+与H2O2反应产生·OH自由基,然后加入水杨酸捕捉并产生有色物质,该有色物质在510 nm处有最大吸收．当有抗氧化剂存在时,·OH自由基的单电子被捕捉而使其颜色变浅,在最大吸收波长处的吸光度会下降,且下降程度呈线性关系,由此可推知体系中·OH自由基量的变化,用于评价实验样品的抗氧化能力[15]．

16种中草药提取液对·OH自由基的抑制率测定结果见表3．

表3　16种中草药提取液对·OH 的抑制率

续表3

由表3可以看出,16种中草药的提取液对·OH自由基也都具有一定的清除能力．其中,红景天、黄精、何首乌、肉苁蓉的无水乙醇提取液对·OH自由基的抑制率均在80%以上;50%乙醇提取液中仅有红景天对·OH自由基的抑制率超过70%;而水提取液对·OH自由基的抑制率均没有达到70%．VC对·OH自由基的抑制率为82.7%．

对表3中前7种中草药的提取液进行浓度梯度稀释,分别测定其对·OH自由基的抑制率,并计算IC50,其值列于表4．

表4　几种中草药提取液对·OH的半抑制率浓度

由表4可见,VC的IC50最小,为0.049 mg·mL-1,对·OH自由基的清除作用最强;中草药提取液中IC50最小的为红景天的无水乙醇提取液(0.193 mg·mL-1),对·OH自由基的清除作用也较强．

2.3　对·O2-自由基的清除能力分析

利用邻苯三酚自氧化法测定抗氧化剂对·O2-自由基的抑制率．邻苯三酚在pH<9.0的条件下发生自氧化反应,产生稳定浓度的·O2-与中间物,中间物又与·O2-反应,生成一种有颜色的中间产物,此物质在紫外波长320 nm处有最大吸收,故可通过紫外-可见光分光光度计来定量测定抗氧化剂在此体系中对·O2-的清除作用,间接评价抗氧化剂的抗氧化能力[16-17]．

16种中草药提取液对·O2-自由基的抑制率测定结果见表5．

表5　16种中草药提取液对·O2-的抑制率

由表5可以看出,16种中草药的提取液对·O2-自由基同样都具有一定的清除能力．其中,肉苁蓉、石榴皮、红景天、何首乌的无水乙醇提取液对·O2-自由基的抑制率均超过70%;肉苁蓉、石榴皮、红景天的50%乙醇提取液对·O2-自由基的抑制率也超过70%;石榴皮、陈皮、丹参的水提取液对·O2-自由基的抑制率也都在70%以上．VC对·O2-自由基的抑制率为97.6%．

对表5中前6种中草药的提取液进行浓度梯度稀释,分别测定其对·O2-自由基的抑制率,并计算IC50,其值见表6．

表6　几种中草药提取液对·O2-的半抑制率浓度

由表6可见,石榴皮(0.213 mg·mL-1)和肉苁蓉(0.253 mg·mL-1)的无水乙醇提取液的IC50较小,对·O2-自由基的清除作用强于VC(0.457 mg·mL-1)．

测定的16种中草药中,多数中草药的无水乙醇提取液对3种自由基的抑制率高于其水提取液,但陈皮、丹参等的水提取液对3种自由基的抑制率却高于其无水乙醇提取液;16种中草药的水提取液对·OH自由基的抑制率均较低．这是因为不同中草药中所含有的抗氧化活性成分的种类和含量不同,同一种中草药采用不同极性的溶剂提取出的抗氧化活性成分不同,同种抗氧化活性物质对不同自由基的清除效果也不尽相同．由于16种中草药的50%乙醇提取液对3种自由基的抑制率均介于其醇提液和水提液之间,因此,只要选择无水乙醇和水作提取剂即可对中草药的抗氧化活性作出综合评价．

3结束语

作者采用分光光度法测定了16种中草药的不同溶剂提取液对DPPH·、·OH和·O2-自由基的抑制率,方法简便．

实验结果表明:16种中草药的不同溶剂提取液对3种自由基都有一定的清除作用．其中红景天、何首乌、肉苁蓉的无水乙醇提取液对3种自由基具有较强的清除能力;石榴皮的3种提取液、陈皮和丹参的水提取液对DPPH·和·O2-自由基具有较强的清除能力;所有中草药的水提取液对·OH自由基的抑制率均较低．

对于不同种类的中草药，使用同一种提取溶剂、同一种抗氧化活性评价方法所测得的抗氧化能力各不相同;对于同一种中草药，使用不同的提取溶剂、用同一种抗氧化活性评价方法所测得的抗氧化能力不同;对于同一种中草药，使用相同的提取溶剂、用不同的抗氧化活性评价方法所测得的抗氧化能力也不同．因此,在筛选具有高效抗氧化活性中草药的过程中,应该选择不同的提取剂,使用多种抗氧化测试方法进行综合评价,以便全面客观准确地评价抗氧化效果,从而筛选出活性高、特异性强的天然抗氧化剂．

参考文献：

[1]李勇,孔令青,高洪,等.自由基与疾病研究进展[J].动物医学进展,2008,29(4):85-88.

[2]马小媛,钱卫平.抗氧化能力评价方法[J].化学进展,2011,23(8):1737-1746.

[3]Stadtman E R, Levine R L.Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins[J]. Amino Acids,2003,25(3/4):207-218.

[4]Poeggeler B, Reiter R J, Tan D X, et al. Melatonin, hydroxyl radical-mediated oxidative damage, and aging: a hypothesis[J]. J Pineal Res,1993,14(4):151-168.

[5]崔剑,李兆陇,洪啸吟.自由基生物抗氧化与疾病[J].清华大学学报,2000,40(6):9-12.

[6]王建英,任引哲,王迎新.氧自由基与人体健康[J].化学世界,2006(1):61-63.

[7]张尊听,贺云,刘谦光,等.分光光度法测定太白山20种中草药的抗氧化活性[J].分析试验室,2002,21(2): 50-52.

[8]陈会良,顾有方,王月雷.中草药化学成分与抗氧化活性的研究进展[J].中国中医药科技,2006,13(1):63-64.

[9]吴青,黄娟,罗兰欣,等.15种中草药提取物抗氧化活性的研究[J].中国食品学报,2006,6(1):284-289.

[10]成喜雨,崔馨,刘春朝,等.中草药抗氧化活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2006,18:514-518.

[11]柳爱莲,刘绣华.天然产物抗DPPH·自由基活性研究[J].周口师范学院学报,2007,24(5):80-82.

[12]孙静涛,董娟,屈静雅,等.酿酒葡萄皮渣中多酚物质的提取及其对羟基自由基的清除研究[J].现代食品科技,2012,28(12):1743-1746.

[13]艾志录,王育红,潘治利,等.苹果渣中多酚物质的抗氧化活性研究[J].食品科学,2006,27(12):160-163.

[14]勾明玥,刘梁,张春枝.采用DPPH法测定26种植物的抗氧化活性[J].食品与发酵工业,2010,36(3):147-150.

[15]张昊,任发政.羟基和超氧自由基的检测研究进展[J].光谱学与光谱分析,2009,29(4):1093-1099.

[16]韩少华,朱靖博,王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].中国酿造,2009,5(6): 155-157.

[17]马森.瓯柑橘皮和陈皮类黄酮体外抗氧化作用[J].畜牧兽医杂志,2010,29(3):9-13.

(责任编辑于敏)

Study on antioxidant activity of the extracts from 16 kinds of Chinese herbs

WANG Xue-mei， WU Han-ping, WANG Xiao-min, LIU Yang, WANG Jia-heng

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Anhui University, Hefei 230601, China)

Abstract:Ultrasonic extraction was used to extract 16 kinds of Chinese herbs with ethanol, 50% ethanol solution and water as solvents. The antioxidant capacity of the extracts was measured and evaluated by three kinds of antioxidant activity evaluation methods in vitro. The results showed that the ethanol extracts of Rhodiola rosea L., Polygonum multiflorum and Herba Cistanche had better scavenging effects to DPPH·,·OH and·O2-free radicals; three kinds of extracts of Punica granatum L. had strong scavenging activity to DPPH·and·O2-free radicals, the same as the water extracts of Citrus aurantium L. and Salvia miltiorrhiza Bge.; and the water extracts of all herbs exhibited lower scavenging effects to·OH free radicial.

Key words:Chinese herb; free radical; antioxidant activity; scavenging effect

通信作者

作者简介：陈赓(1989-),男,安徽滁州人,安徽大学硕士研究生;*潘忠稳(),安徽大学教授级高工,硕士生导师,E-mail:ahpzw@163.com.

收稿日期：2014-08-31

doi:10.3969/j.issn.1000-2162.2015.02.014

中图分类号：Q503

文献标志码:A

文章编号:1000-2162(2015)02-0074-07