法舒地尔对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中Nogo-A的影响①

孟庆云，李 丽，邵 巍，聂 磊

(1.佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003；2.牡丹江医学院附属医院儿内科，黑龙江 牡丹江 157000)

法舒地尔对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中Nogo-A的影响①

孟庆云1，李 丽1，邵 巍2，聂 磊1

(1.佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003；2.牡丹江医学院附属医院儿内科，黑龙江 牡丹江 157000)

目的：探讨法舒地尔对缺氧缺血性脑损伤大鼠Nogo-A表达的影响。方法： 将105只新生7日龄Wistar大鼠随机分为6h、12h、24h、72h和7d时段的假手术组(Sham组，35只)、缺氧缺血性脑损伤模型组(HIBD组，35只)、法舒地尔治疗组(35只)，分别腹腔注射生理盐水和法舒地尔(10mg/kg)。HE染色镜下观察脑组织病理变化。免疫组化法检测Nogo-A表达。结果：①肉眼观察：Sham组两侧大脑半球对称；HIBD组随时间延长脑组织水肿加重，可见大脑半球坏死灶；法舒地尔治疗组脑组织水肿减轻。②HE染色：Sham组脑组织结构形态正常。HIBD组可见细胞肿胀，核固缩、裂解，炎性细胞增多；法舒地尔治疗组神经细胞水肿及核固缩数量减少。③免疫组化：Sham组Nogo-A可见少量表达；HIBD组Nogo-A阳性细胞12h开始升高，24h达峰值，随后表达逐渐降低；法舒地尔治疗组除6h时间点外，各时间点的表达均低于HIBD组(P<0.01)；HIBD组和法舒地尔组阳性细胞数多于Sham组(P<0.01)。结论：法舒地尔通过抑制Nogo-A的激活，促进了轴突再生和修复，保护神经细胞，为临床防治HIBD提供了实验性的理论基础。

缺氧缺血性脑损伤；Nogo-A；法舒地尔；神经再生

缺氧缺血性脑损伤(hypoxicia-ischemicbraindamage,HIBD)是常见的引起新生儿神经系统后遗症的疾病, 其原因是由于中枢神经缺氧缺血损伤后难以再生修复所致，它严重的影响了新生儿的生命及健康安全。目前认为引起神经系统轴突再生的障碍的主要原因之一为生长抑制因子，缺氧缺血性脑损伤过程中，抑制因子直接或间接地激活细胞内Rho激酶(Rhokinase，Rock)信号传导通路，从而导致肌动蛋白骨架的重组和轴突生长锥的塌陷，使得轴突再生过程被迫阻断。Nogo-A(Nogo髓鞘相关蛋白)因为具有很强的轴突生长抑制作用而倍受关注[1]；Rock抑制剂应用在动物实验中，可以促进不同程度的轴突再生，可以修复受损伤的神经细胞。而法舒地尔因为其对Rock具有较为明显的抑制作用，并具有显著的神经保护作用而逐渐的引起人们的广泛重视。本课题是利用新生大鼠的HIBD模型来探讨法舒地尔对Nogo-A的影响及其对神经再生的促进作用，为今后临床治疗HIBD提供了一种崭新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂:盐酸法舒地尔注射液：天津红日药业股份有限公司；Nogo-A抗体、SABC(兔IgG)试剂盒：武汉博士得生物工程有限公司；混合气体(氮气:92%,氧气：8%)：佳木斯市金鼎氧气厂；DAB显色剂、抗体稀释液：北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.1.2 模型制备:参照Rice方法[2]制备新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤模型：新生大鼠给予乙醚吸入麻醉后取仰卧位, 同时固定四肢, 取其颈部正中切口，结扎左侧颈总动脉，缝合好切口后放回原来的饲养环境中让其恢复2～4h，之后放入 2000mL的密闭容器内, 放置于在37℃的水浴中，持续维持容器内的温度为36℃ , 同时以 2～3L/min的速度持续输入8%的氧气和92%的氮气混合气体共 2～ 4h。

1.1.3 分组:健康清洁级的Wistar大鼠(280±20)g(购自大连医科大学实验动物中心)合笼后所生的120只7日龄清洁级的大鼠体重(12.5±3)g，随机分为3组：Sham组、HIBD模型组、法舒地尔治疗组，每组各35只。Sham组只做了左侧颈总动脉的分离、不结扎，直接缝合切口，不做缺氧处理；HIBD组造模后给予生理盐水0.25mL/kg腹腔内注射；治疗组在HIBD后立即给予腹腔内注射法舒地尔10mg/kg，每日一次。分别于6h、12h、24h、72h、7d不同的时间点给予断颈、处死。

1.1.4 取材:各组实验大鼠在相应的观察时间点处死，用10%的水合氯醛腹腔内注射麻醉，并开胸充分暴露心脏，经左心室迅速插管至主动脉，注入生理盐水100mL，同时在右心房处剪一切口，直到流出的液体澄清为止。再次注入4%的多聚甲醛、0.lmol/LPBS的(pH7.4)100mL，等到肝脏已经明显变白同时肺脏明显水肿后断其头并取全脑，同时立即保存于4%的多聚甲醛、0.1mol/LPBS的(pH7.4)溶液中，固定72h以上。之后把固定的鼠脑从视交叉后2～6mm处做脑组织的冠状切面，并取其脑组织脱水、石蜡包埋。行冠状切片(20μm)连续切片,每20张选取1张作免疫组化，并取部分切片给予HE染色。

1.1.5 形态学检测：鼠脑组织的常规石蜡切片、HE染色, 光镜观察其脑组织的形态。

1.1.6Nogo-A免疫组化染色： 脑组织，制备连续切片，按试剂盒操作，一抗为(Nogo-A)1：100稀释。二抗是山羊抗兔IgG，DAB显色， 胞浆染成棕褐色的或棕黄色的为Nogo-A阳性细胞。采用阳性细胞计数法，于每张切片随即选取5个不重复视野，在400倍的物镜下计数Nogo-A的阳性细胞数，计算其平均值。

1.2 统计学方法

采用SPSS.19.0软件进行统计学分析。对各组的数据给予正态性检验和方差齐性检验比较各组数据均数，进行单因素方差。用均数±标准差表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肉眼观察新生大鼠的脑体形态

Sham组大脑未见任何改变，大脑半球左右对称。HIBD组：6h时结扎侧的脑组织呈现轻度水肿；至12～24h时水肿较明显， 到72h-7d时结扎侧的大脑半球可见坏死病灶，脑半球的形状发生改变。而法舒地尔治疗组的脑组织水肿较HIBD组减轻，并且未见到液化坏死病灶。

2.2 HE染色

Sham组：脑组织的各部位结构清晰、脑细胞层次清楚、形态正常。HIBD模型组：缺氧缺血12～24h时细胞肿胀，淡染空亮，胞浆疏松，神经元的排列紊乱、数目减少，于72h～7d时细胞核裂解、固缩，炎性细胞增加。法舒地尔治疗组：各时间点的细胞水肿、核固缩数量均少于模型组。见图1。

图1 光镜观察新生大鼠脑组织形态×100

2.3 Nogo-A免疫组化

Sham组Nogo-A阳性颗粒有少量分布于细胞胞浆中，呈现棕黄色；HIBD组各时段Nogo-A阳性细胞表达在造模的12h开始逐渐上升，到24h时达到高峰，随后逐渐下降，与Sham组的Nogo-A阳性细胞数对比，有显著差异(P<0.01)；法舒地尔治疗组的表达部位及其变化的规律与HIBD组相似，阳性细胞数分别在12h,2h,72h和7d的表达均低于HIBD组，有显著的统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠不同时段Nogo-A阳性细胞数比较

注：a与Sham组相比较，P<0.05；b与HIBD组相比较，P<0.05。

3 讨论

HIBD是新生儿所患的较为严重的神经系统疾病，可引起神经系统的严重后遗症，其后遗症的发生与脑神经的再生障碍密切相关。中枢神经系统(CNS)损伤后的再生修复能力取决于神经元自身的再生能力及在神经元生存环境条件中各种外源性的生长促进性因子和抑制性因子的共同影响。目前人们已经发现3种神经轴突生长抑制因子：Nogo髓鞘相关蛋白(Nogo-A)，髓鞘相关糖蛋白，少突胶质细胞髓鞘糖蛋白。而Nogo是一个与中枢髓磷脂相结合的特异性的抑制因子, 在CNS中广泛表达，参与多种CNS疾患的发病[3～5]，它是抑制中枢神经轴突再生的重要因素之一。在HIBD发生后，中枢神经细胞轴突的生长被抑制与激活Rock关系密切，Nogo-A通过神经元细胞膜上的受体与NgR结合、激活后并将Rock激活，让其活化，导致生长锥塌陷，轴突的再生被抑制。而损伤区内的神经细胞在多种不利因素的影响作用下变形、坏死、结构被破坏、细胞出现崩解，从而失去了它原有功能。而损伤区外的邻近神经元开始合成及积存神经丝蛋白(它是髓鞘轴突中含量最多的蛋白，对维持神经元的形态和轴浆运输及损伤神经的修复非常重要)，以适应神经再生需要，最终修复神经元。

在实验中，以新生7日龄大鼠为对象建立的HIBD模型，我们通过观察当发生缺氧缺血性损伤时，Nogo-A表达评估轴突损伤和再生反映，结果是Sham组新生大鼠的Nogo-A阳性细胞在海马区、大脑皮层的神经元及胶质细胞中都有表达，由此表明了Nogo-A在正常的脑组织中是存在的，并且可能参与着神经系统的发育和生长的调控。HIBD组12h表达升高，24h达到峰值，随后表达逐渐降低。推测在脑损伤急性期Nogo-A表达增加，抑制轴突的再生；当Nogo-A的表达达到峰值时，此时对轴突再生的抑制达到最大；随着Nogo-A表达的降低，抑制作用逐渐减少。 法舒地尔是一种新型的异喹啉磺胺衍生物，它有良好的水溶性，对Rock有较强的抑制作用，是目前临床上唯一可用的Rock选择性抑制剂，且在脑组织中含量较高[6,7]。法舒地尔能够保护神经细胞，提高神经功能，促进轴突再生[8]。梁燕[9]临床实践表明法舒地尔对缺血性脑卒中，急性脑梗死，急性脑栓塞等疾病均有很好的治疗效果[10～12]。我们的研究发现，法舒地尔可有效的抑制新生大鼠脑缺血再灌注后Nogo-A及Rock的激活，能拮抗Nogo-A的抑制作用，从而促进轴突的再生。本实验结果显示：法舒地尔治疗组无论是在肉眼观察新生大鼠的脑体形态、还是HE染色的检查结果均显示：应用法舒地尔后新生大鼠的脑组织损伤程度均轻于HIBD组； 而Nogo-A阳性细胞数在12h,24h,72h,7d的表达均较HIBD组低；提示给予法舒地尔治疗HIBD后可以抑制Nogo-A的表达。因此，在新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤的实验中，法舒地尔可能通过抑制Rho/Rock通路和抑制Nogo-A的激活，而促进了轴突再生和修复，这为临床防治HIBD提供了实验性的理论基础。

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黑龙江省卫生厅立项项目，项目编号：2012-195。

孟庆云 (1967～)女，黑龙江林口人，学士，副主任医师。

R722.1

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1008-0104(2015)04-0010-02

2015-03-24)