小脑顶核通过小脑-下丘脑通路参与卒中后抑郁的实验观察

李 媛，隋汝波，张 欣，林宇涵

（1．辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁锦州 121001；2．抚顺矿务局总医院药剂科，辽宁抚顺 113008；3．辽宁医学院生理学教研室，辽宁锦州 121000）

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中最常见并发症之一，占卒中患者的39%～52%［1］，然而PSD的发病机制仍未明。

近期ROBINSON等提出了PSD炎性细胞因子学说。然而导致炎性细胞因子持续升高的始动因素仍未知。我们在观察电针刺激PSD大鼠完骨穴，此穴位对 应于小 脑顶 核 （medial cerebellar nucleus，Med）的前期研究中发现，与PSD组相比，电针组大鼠的抑郁行为学测试明显改善［2］。因此，我们猜想Med损伤极可能是PSD的发病机制［3］。

另外，近年研究证实电刺激Med能显著降低炎性细胞因子水平［4］，而破坏 Med后血中炎性细胞因子产生增加［5］。神经解剖学研究表明，下丘脑是免疫功能调节的最重要中枢［6-7］，Med发出的纤维，经小脑上脚交叉（superior cerebellar peduncle，xscp）投射至对侧下丘脑，主要分布在下丘脑外侧区（lateral hypothalamic area，LHA）［8］。 因 此，有 理 由 相 信Med对炎性细胞因子的影响极可能是通过下丘脑实现的。为此，本研究从小脑-下丘脑投射入手进一步揭示Med损伤致PSD发病的作用途径。

1 材料与方法

1．1 动物 选用成年SD大鼠50只，体质量250～300g，雌雄兼有。大鼠给予自由饮水和进食，白天和夜晚各12h的睡眠、活动时间。

1．2 分组 大鼠随机分为5组，每组10只。为假手术组、卒中组、PSD组、Med损毁组、xscp损毁组。

1．3 模型建立

1．3．1 假手术组 仅切开皮肤不行大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）术。

1．3．2 卒中组 行 MCAO 手术［9］，大鼠腹腔注射40g／L水合氯醛（4mL／kg）麻醉，仰卧位固定于手术台上。颈部正中切开后，钝性分离周围组织，暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）和迷走神经。用微动脉夹暂时夹闭CCA。距CCA分叉处近心端0．5cm处将CCA剪一小口，插入肝素化的烧头尼龙线从CCA沿着ICA推进，阻断大脑中动脉（MCA）血流。进入ICA的尼龙线从CCA分叉处到MCA大约18mm左右，有效地阻断了MCA血流。结扎CCA并固定鱼线。

1．3．3 PSD组 使用 MCAO模型，18d慢性温和刺激（chronic mild stress，CMS）与隔离饲养。CMS改编自Willner的方案［10］。9种刺激每天随机采取1种，为期18d：①禁食禁水20h；②禁水17h；③倾斜鼠笼（45°）17h；④隔夜光照36h；⑤脏笼（100g锯末＋200mL水）21h；⑥4℃游泳5min；⑦水平摇晃5min；⑧行为限制2h；⑨夹尾1min。将动物单独饲养，不接触其他动物。

1．3．4 Med损毁组［11］使用 MCAO 模型，大鼠腹腔注射40g／L水合氯醛（4mL／kg）麻醉后固定于脑立体定位仪上（David Kopf 902-A，美国）。在双侧Med内，分别缓慢注入1g／L海人酸（Kainic acid，KA）（Sigma）溶液0．4μL，注射部位依据《Paxions ＆Watson大鼠脑图谱》［12］Med （A：-11．6，L：0．4～1．0，H：5．5～6．2），注射完留针10min，徐徐起针，缝合创面。注射完毕，动物注意保暖等待麻醉后恢复。手术后常规饲养7d。

1．3．5 xscp损毁组［13］使用 MCAO模型，大鼠麻醉和固定的方法同上。依据《Paxions ＆Watson大鼠脑图谱》［12］xscp（坐标为 A：6．7～8．0，L：0，H：7．8～8．0）。损毁电极（同心圆电极NEX100，外径0．25mm，直流阻抗3～6MΩ），连接A320R型隔离刺激器（美国WPI公司）通以直流电，强度0．5mA，持续10s，电损毁后留针10min，徐徐起针缝合创面。术后处置同上。

1．4 行为学观察和测试 在各组大鼠第7、14、21天测量体质量，行旷野实验、蔗糖水实验。①旷野实验：室内隔音，测定5min水平运动得分；②蔗糖水实验：10h禁食禁水后，同时给予10g／L蔗糖水和纯水1瓶，测定1h糖水饮用比例（糖水消耗／总液体消耗×100%）。

1．5 微透析 大鼠经腹腔注射200g／L乌拉坦（8mL／kg）麻醉剂麻醉后固定于脑立体定位仪上。依据《Paxions ＆ Watson大鼠脑图谱》［12］LHA（A：-1．8～2．56，L：1．4～2．6，H：7．6～8．4）。微透析探针（CMA12，瑞典）滤过膜长度为1mm。钻孔开颅后将透析探针按坐标植入，以人工脑脊液2μL／min的速度灌流，所得的透析液流入冰浴的收集管中，前1h的透析液弃去，每隔30min收集1管，共2管。收集好的透析液立即放入-80℃冰箱中冷冻待测。最终参与统计的Glu和GABA值取2管透析液测定值的平均值。

1．6 高效液相色谱-荧光法检测Glu、GABA水平HPLC系统包括Aglient1200、G1321A荧光检测器、化学工作站。色谱柱（Eclipse AAA 4．6mm×150 mm，5μm），衍生液：将5mg OPA溶于120μL加入β-巯基乙醇10μL和0．2mol／L硼酸缓冲液（pH＝9．2）1mL，混匀，存放于暗处备用。流动相：A液为缓冲液∶甲醇∶四氢呋喃（V∶V∶V）＝400∶95∶5；B液为缓冲液∶甲醇（V∶V）＝120∶380（缓冲液为20 mol／L乙酸钠溶液，pH＝7．2）。流速：0．8mL／min；PMT：12；柱温：40℃。梯度洗脱：0～10min为0%～63%B液；10～20min为63%B液；12～17min为100%B液；17～18min为100%～0%B液；18～21min为0%B液。OPA柱前自动衍生；激发波长340nm，发射波长455nm。

2 结 果

2．1 动物模型损毁及微透析脑组织Nissl染色的病理学改变 大鼠Med注射KA后的小脑Nissl染色切片，可见Med内的Nissl小体基本消失，损毁仅限于Med，在Med上方见一注射针道（图1A）；电毁损xscp后，该部位有近似球形的空洞形成，空洞以电极尖端为中心（图1C）；Nissl染色切片上，Med上方见微透析探针的针道，针道周围伴有出血（图1E）。

图1 动物模型损毁及微透析脑组织Nissl染色的病理学改变Fig．1 Pathological changes of brain tissue Nissl staining after lesion or microdialysis

2．2 各组大鼠行为学评分的变化 无论是在7、14、21d，与卒中组比较，PSD组大鼠体质量下降，蔗糖水消耗减少，旷野试验水平运动评分也减少（P＜0．01）。而与PSD组比较，无论是Med损毁组还是xscp损毁组的差异并不显著（P＞0．05，表1～表3）。

表1 各组大鼠不同时间点体质量的变化Tab．1 Rat body mass in different groups at different time points（g，±s）

表1 各组大鼠不同时间点体质量的变化Tab．1 Rat body mass in different groups at different time points（g，±s）

与卒中组比，＊P＜0．01，n＝10。

组别 时 间7d 14d 21d假手术组278．6±22．6 291．4±27．1 304．3±29．3卒中组 285．3±23．5 307．3±24．5 305．2±25．3 PSD组 280．9±22．6＊ 265．1±18．1＊ 252．4±20．1＊Med损毁组 283．2±24．2＊ 271．2±25．2＊ 258．4±21．7＊xscp损毁组 285．3±25．2＊ 276．3±23．8＊ 264．5±22．3＊

2．3 各组大鼠LHA细胞外Glu、GABA水平的比较无论是在7、14、21d，假手术组LHA细胞外 Glu、GABA呈高水平表达；与假手术组比较，卒中组LHA细胞外Glu、GABA含量没有差别（P＞0．05）。与卒中组相比，PSD时Glu水平显著下降（P＜0．01）。相比之下，无论是Med损毁后还是xscp损毁后Glu水平都没有显著的变化（P＞0．05，图2）。有趣的是，Med损毁后LHA细胞外GABA几乎完全取消了。而xscp损毁的大鼠GABA水平虽然下降但仍可检测出，但明显比PSD组大鼠低（P＜0．05，图2）。各组内各时间点Glu、GABA水平无统计学差异（图2）。

表2 各组大鼠不同时间点蔗糖水消耗的变化Tab．2 Sugar consumption in rats of different groups at different time points（mL，±s）

表2 各组大鼠不同时间点蔗糖水消耗的变化Tab．2 Sugar consumption in rats of different groups at different time points（mL，±s）

与卒中组比，＊P＜0．01，n＝10。

组别 时 间7d 14d 21d假手术组40．6±4．3 38．4±4．1 37．3±4．5卒中组 38．3±6．2 37．5±4．7 34．8±5．5 PSD组 25．6±3．8＊ 19．8±4．9＊ 16．7±3．2＊Med损毁组 22．5±3．9＊ 17．7±4．6＊ 15．4±5．7＊Xscp损毁组 22．6±4．7＊ 16．1±3．9＊ 14．7±5．6＊

表3 各组大鼠不同时间点旷野实验水平运动评分的变化Tab．3 Horizontal motion of rats in different groups at different time points（cm，±s）

表3 各组大鼠不同时间点旷野实验水平运动评分的变化Tab．3 Horizontal motion of rats in different groups at different time points（cm，±s）

与卒中组比，＊P＜0．01，n＝10。

组别 时 间7d 14d 21d假手术组55．6±4．5 58．3±3．1 60．9±4．7卒中组 51．1±4．7 55．6±5．3 55．8±4．2 PSD组 39．1±4．4＊ 33．4±3．8＊ 27．2±2．9＊Med损毁组 38．4±4．2＊ 32．5±2．4＊ 29．2±3．2＊xscp损毁组 35．6±2．6＊ 31．7±4．3＊ 30．3±2．1＊

图2 各组大鼠LHA细胞外Glu、GABA水平的比较Fig．2 Comparison of extracellular LHA glutamate and GABA levels in different groups of rats

3 讨 论

本实验通过颈内动脉线栓法制备左侧局灶性脑缺血大鼠模型，在此基础上给予18d慢性温和刺激与隔离饲养。此后，进行行为学检测，结果显示无论是在7、14、21d，大鼠都出现显著的体质量持续减轻、蔗糖水消耗量持续降低、旷野试验水平运动明显异常。这模拟了PSD患者卒中后出现的体质量下降、兴趣感减退、活动减少等表现。我们利用KA仅损毁神经元胞体而不影响神经纤维的特性，在Med内注射KA来破坏Med的神经元胞体，Nissl染色证实了Med内的Nissl小体基本消失。我们也应用电损毁技术，在xscp部位局限性地损毁Med至下丘脑的投射神经纤维，Nissl染色证实xscp部位有近似球形的空洞形成。以上均说明本实验制备的各组大鼠模型成功。

以往应用顺行或逆行神经束追踪剂研究表明，小脑和下丘脑之间存在着结构上的直接双向神经纤维投射，其中Med的离核纤维可走行于小脑上脚，至xscp交叉到对侧，直接投射到下丘脑的众多核团，构成小脑-下丘脑直接投射［14］。本研究结果表明，Med损毁组大鼠和xscp损毁组大鼠体质量减轻、蔗糖水消耗降低、旷野试验水平运动评分减少，并且与PSD组大鼠相比，差异无统计学意义。因此，我们可以得出当大鼠卒中后Med病变或小脑-下丘脑通路发生病变后也会出现抑郁的表现。

电生理学研究也从功能上证明，电刺激Med可引起LHA神经元产生单突触和多突触反应，且以单突触反应为主，其中单突触反应大多为抑制性，而多突触反应以兴奋性为主［15］。免疫组织化学研究也证实了小脑-下丘脑投射的神经递质是GABA或Glu［14-15］。鉴于上述研究，本实验把GABA和Glu作为检测指标，结果发现，与卒中组比较，PSD组大鼠LHA细胞外Glu、GABA水平都有不同程度的降低，GABA下降的更多。同时KA毁损大鼠双侧Med后，LHA细胞外Glu、GABA水平显著下降，提示Med功能下降可能参与了PSD的发病。另外，我们进一步应用电损毁技术，在xscp处损毁Med至下丘脑投射的神经纤维，大鼠LHA细胞外Glu、GABA水平下降，这些结果与损毁Med神经元后的结果一致。因而，提示Med可能通过小脑-下丘脑通路的神经投射参与了PSD的发病。

本研究从结构和功能上证明，Med可能通过小脑-下丘脑通路的神经投射参与了PSD的发病，但Med如何通过该通路参与PSD的发病，至今机制未明。国内彭聿平等［16-17］研究发现，Med至下丘脑的神经投射是GABA能和Glu能神经投射，他们均参与了Med对炎性细胞因子的调节。进一步研究发现，破坏Med或小脑-下丘脑通路后炎性细胞因子水平明显升高，提示Med至下丘脑的神经投射参与了Med对炎性细胞因子的调节作用。结合PSD炎性细胞因子学说［18-19］，我们进一步推测损伤的 Med可能通过小脑-下丘脑通路的神经投射参与了Med对炎性细胞因子的调节作用，致使炎性细胞因子水平明显升高，升高的炎性细胞因子通过多种机制导致PSD的发病。

综上所述，本实验初步提示小脑顶核可能参与了卒中后抑郁的发病，这种参与可能通过小脑-下丘脑通路介导。这些结果可为进一步研究PSD发病机制提供了一些依据。

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