三硝基苯磺酸／乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用

张超贤，郭李柯，郭晓凤

（1．新乡医学院第一附属医院消化内科，河南卫辉 453100；2．新乡医学院第一附属医院口腔内科，河南卫辉 453100；3．杭州市第六人民医院肝病科，浙江杭州 310014）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的病因和发病机制与免疫功能紊乱有密切的联系。促炎细胞因子上调，可诱导和促进炎症发生，在UC的形成中起重要作用，而且这些细胞因子的表达和分泌量均与UC疾病的炎症程度呈正相关。TNF-α和IL-1β是两种重要的促炎细胞因子，通过免疫组化染色已证实TNF-α、IL-1β蛋白在UC肠黏膜细胞中呈高表达状态［1-2］；核转录因子-κB（NF-κB）广泛存在于各种细胞中，可调控多种基因、细胞因子及生长因子的转录表达，参与调控机体免疫应答、炎症反应、细胞凋亡及肿瘤形成等多种生理和病理过程，与UC关系密切。国内外研究表明，NF-κB在UC患者机体内呈现过度激活状态，导致并调控UC患者TNF-α、IL-1β等细胞因子过度和持续表达，从而参与了UC的发生和发展。toll样受体4（TLR4）NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信号通路是活化NF-κB的两条重要途径［3-4］。电针对UC有良好的治疗效果［5］，但这种作用是否与其阻断 TLR4／NF-κB 和 PI3K／AKT／NF-κB 信 号 通路、抑制NF-κB活性及下游促炎细胞因子的表达有关尚不清楚。本研究以三硝基苯磺酸（TNBS）诱导大鼠 UC，以 TLR4单克隆抗体（TLR4mAb）和PI3K／AKT特异性抑制剂LY294002作为治疗对照组，观察电针对UC大鼠结肠黏膜病理组织学、TLR4／NF-κB和 PI3K／AKT／NF-κB通路和下游促炎细胞因子表达的影响，进一步探讨电针治疗UC的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料 成年雄性健康清洁级 Wistar大鼠240只，体质量180～220g（由新乡医学院实验动物中心提供）。2、4、6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司）；LY294002（美国Promega公司）；TLR4mAb（Biolegend公司）。DelDoc2000凝胶扫描仪（BLO-Rad公司，美国）；Trizol试剂 （美 国Invitrogen 公 司）；TLR4、PI3K、AKT、NF-κB、TNF-α、IL-1β及 β-actin基因引物（上海生工生物工程公司）；RT-PCR（一步法）试剂盒（宝生物工程有限公司）；NE-PER核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；抗磷酸化 Akt（ser473）抗体购自 CellSignalingTechnology；NF-κB兔抗鼠多克隆一抗和 HRP羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司。

1．2 动物分组与模型制作 SD大鼠术前禁食24h，自由饮水，随机分为6组：正常对照组、模型组、电针组、TLR4单克隆抗体（TLR4mAb）组、LY294002组、TLR4mAb＋LY294002联合治疗组，每组各40只。正常对照组不造模，模型组和治疗组参考文献［6］的方法造模，腹腔注射100g／L的水合氯醛使大鼠轻微麻醉，而后将一直径2．0mm、长约12cm的硅胶管用石蜡油润滑，由肛门轻缓插入大鼠体内深约8cm，缓慢注入含100mg／kg TNBS的等容积无水乙醇溶液，然后提起大鼠尾部，持续倒置10min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。造模后，自然清醒，自由饮食。造模后第3天，各组开始给药，连续4周。电针组取双侧足三里穴，采用华佗牌30号半寸毫针，针尖圆滑，针刺时大鼠固定为仰卧位，对足三里穴做常规消毒，术者右手持针，针体与皮肤呈90°刺入皮下，进针深度为0．5cm，连接G6805电针治疗仪，将电针仪调整如下：调整输出调节旋钮置于1档（即输出电压为1V保持不变）频率20Hz，每次留针30min，每日2次，1周为一疗程，疗程间休息2～3d，共4周。TLR4mAb组、LY294002组分别按5μg／（100g·d）和30μg／（100 g·d）腹腔注射。正常组和模型组以等体积8．5g／L氯化钠灌肠。在造模过程中模型组和LY294002组各死亡1只。实验4周后，末次给药24h后，脱颈椎法处死大鼠，取距肛门8cm结肠，沿纵轴剪开，刮取肠黏膜组织，即置于液氮中速冻，转入-70℃冰箱保存。

1．3 UC疾病活动指数（disease activity index，DAI）［7］在造模过程中，每天称重，记录大便情况，检测便潜血、计算DAI。DAI结合大鼠的体质量下降百分率（体质量不变为0，1～5为1分，5～10为2分，10～15为3分，大于15为4分）、大便黏稠度（正常为0，松散的大便为2分，腹泻为4分）和大便出血（正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分）3种情况进行综合评分，将3项结果的总分除以3即得到DAI值。即DAI＝（体重指数＋大便形状＋出血情况）／3。

1．4 结肠黏膜损伤指数（colonic mucosa damage index，CMDI）［8］肉眼观察结肠病变组织肠黏膜形态，以正常、糜烂、溃疡分级描述，进行结肠黏膜大体形态损伤指数评分：0分：无损伤；1分：轻度充血、水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡；2分：轻、中度充血、水肿、糜烂，无溃疡；3分：高度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径＜1cm，肠壁增厚或表面有坏死及炎症；4分：在3分基础上溃疡最大纵径＞1cm，或全肠壁坏死。

1．5 组织学损伤指数（tissue damage index，TDI）［9］取病变最明显处组织置于100mL／L甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，HE染色，用于结肠组织形态观察、光镜观察。评分标准如下：①炎细胞浸润：无0分，轻度1分，重度2分；②浸润深度：黏膜层1分，黏膜和黏膜下层2分，结肠全层3分；③溃疡深度：无0分，上皮1分，黏膜固有层2分，黏膜肌层3分。

1．6 核蛋白、胞质蛋白的提取 剪取结肠组织20 mg，4℃组织匀浆，500×g离心3min弃上清，加入CERⅠ200μL，高速涡旋15s，冰浴10min，加入CERⅡ11μL，涡旋5s，冰上孵育 min，涡旋5s，4℃1 600×g离心5min，取上清即为胞质蛋白，将沉淀用预冷的NER 100μL重悬，涡旋5s，冰浴10min，并重复4次，最后4℃1 600×g离心10min，取上清即为胞核蛋白。

1．7 Western blot法检测结肠组织AKT的表达 取100μg胞质蛋白样品于100g／L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转印至PVDF膜，用封闭液（50g／L脱脂奶粉、0．05%Tween-20TBS）封闭后，加抗磷酸化Akt抗体（1∶1 000）、抗 Akt抗体（1∶1 000）孵育，4℃过夜。次日，再与辣根过氧化物酶标记的相应二抗于室温孵育2h。最后，加ECL，X光曝片显影，凝胶成像系统分析吸光度（A）比值。

1．8 Western blot法检测结肠组织活化NF-κB的表达

用CBA蛋白浓度测定盒进行蛋白定量后，每孔上样50μg，蛋白样品与上样缓冲液共同煮沸3min，采用50g／L浓缩胶和12分离胶，100V，100min转至PVDF膜，50g／L脱脂牛奶室温封闭2h，一抗1∶1 000，4℃过夜。二抗1∶2 000，室温4h，采用GAPDH作内参，化学发光现象于X光片。

1．9 TLR4mRNA的检测 用 Trizol（Invitrogen公司）抽提RNA后，采用RT-PCR法检测TLR4mRNA，TLR4mRNA引物序列：上游5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，下游5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′，扩增产物长度508bp。内参β-肌动蛋白序列：上 游 5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下 游5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，扩 增 产 物 长 度250bp。RT反应条件为：30℃反应10min；50℃30 min灭活转录酶；99℃5min。TLR4mRNA扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸8min。PCR产物在20g／L的琼脂糖凝胶中电泳，加样量为5μL。分析PCR产物，测定扩增带（目的条带和βactin）的吸收度值，计算TGF-β1mRNA与β-肌动蛋白的吸光度比值。

1．10 PI3KmRNA的检测 Trizol试剂提取组织总RNA，采用 RT-PCR法检测 PI3KmRNA，PI3K mRNA 引 物序 列：上 游：5′-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3′，下游：5′-CAGTT2GTTGGCAATCTTCTTC-3′，扩增产物长度377bp。β-actin引物序列：上 游：5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3′，下游：5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，扩增产物长度217bp。扩增条件为：95℃预变性5min后进入30个循环（94℃0．5min，56℃1min，72℃1min），最后72℃延伸7min；扩增产物在18g／L琼脂糖凝胶上电泳分离，并在图像分析软件中计算每个样本扩增产物与β-actin的灰度比值。

1．11 AKT mRNA的检测 取结肠组织用Trizol试剂提取大鼠结肠总RNA并测定纯度后，在逆转录酶（MLV）催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增。AKT mRNA引物序列：上游：5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3′，下 游：5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3′，扩增产物长度361bp。GAPDH为内参照，其上引 物：5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3′，下 游：5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3′，扩增片段为291bp。扩增条件为：预变性95℃2min后，进入循环，95℃ 20s、59℃ 25s、72℃ 30s，45个循环后72℃延长5min。将PCR产物在20g／L琼脂糖凝胶中进行电泳，置于MUVB。20凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，以GADPH为内参照，用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1．12 NF-κB mRNA的检测 Trizol试剂盒提取大鼠结肠组织总 RNA，NF-κB mRNA（178bp）引物序列为上游引物：5′-CAAGATCTGCCGAGTAAACC-3′，下 游 引 物：5′-TCGGAACACAATGGCCACTT-3′。扩增产物全长178bp。以GAPDH作为内参照，其引物序列为上游引物：5′-AGAACGGGAAGCTCACTGG-3＇，下 游 引 物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGGA-3′，扩增产物全长307bp。PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃补充延伸5min。上述反应结束后将PCR扩增产物4℃冰箱保存备用。取PCR产物5μL，15g／L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相，在图像分析系统上进行密度扫描，用NF-κB基因扩增产物的密度与GAPDH基因扩增产物的密度比值表示NF-κB mRNA的表达水平。

1．13 TNF-αmRNA的检测 Trizol试剂盒提取大鼠结肠组织总RNA，TNF-α的上、下游引物分别为：上 游 5′-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3′；下 游为：5′-GGATGAACACGCCAGTCGCC-3′，扩 增 产物全长255bp，β-actin的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物为：5′-GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′，扩增产物全长374bp。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火TNF-α为54℃，β-actin为55℃，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min，扩增产物进行15g／L琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。用目的基因与β-actin吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1．14 IL-1βmRNA的检测 Trizol试剂盒提取大鼠结肠组织总RNA，IL-1β引物序列如下：上游5′-CTCTGCTTGAGAGGTGCTGATGTAC-3′，下 游5′-CTGTATCCATCGACGGTGTCGAAG-3′。扩增产物全长519bp，β-actin序列如下：上游5′-CCTAGCACCATGAAGATCAA-3′。下游5′-AGCCATGCCAAATGTCTCAT-3′，扩增产物全长253bp，扩增条件为：预变性94℃4min，循环，94℃变性60s，58℃45s，72℃45s，共38个循环，72℃延伸10 min，取10μL PCR扩增产物，以DL2000作为分子质量标准，进行12g／L的琼脂糖凝胶电泳（含0．5mg／L EB）。电泳后进行凝胶电泳图像扫描分析。电泳结果以IL-1βmRNA的表达相对量来表示，即IL-1βmRNA／β-actin的比值来表示。

1．15 统计学处理 应用SPSS 11．5统计学软件进行分析。数据以均数±标准差（±s）表示，多组两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间析因分析用LSD检验，相关分析采用直线相关的积差相关分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 电针对UC大鼠DAI、CMDI及TDI的影响正常对照组大鼠大便正常、体质量增加、毛发有光泽、活动均正常；结肠膜黏上皮完整、连续，黏膜下无充血水肿，腺体排列整齐，未见显著炎性细胞浸润。模型组大鼠精神萎靡，毛发无光泽，懒动，常卷缩而卧，饮食量减少，体质量下降，出现黏液稀粪，且逐渐加重。大体形态观察可见肠道粘连，局部结肠黏膜不同程度充血、水肿、糜烂和溃疡形成。HE染色观察见结肠黏膜结构遭严重破坏，部分区域黏膜坏死、脱落，有些病变深达黏膜下层、肌层或浆膜层；黏膜内腺体排列紊乱或缺如，细胞高度水肿，充血明显，并呈局灶性出血，细胞间质可见大量炎性细胞浸润（P＜0．01）。各治疗组大鼠毛色、精神及活动度较模型组健康，其腹泻、便血症状都有不同程度的减轻，治疗组在溃疡数、糜烂点个数均较模型组明显减少，同时炎症细胞浸润和杯状细胞减少程度也减轻（P＜0．05或P＜0．01）。其中电针组和T＆L组治疗效果优于单用TLR4mAb或LY294002组（P＜0．05），电针组与 T＆L组在各项检测指标的比较中大体相当（P＞0．05，表1、图1）。

表1 各组大鼠DAI、CMDI及TDI的比较Tab．1 Comparison of DAI，CMDI and TDI among the 6groups（±s）

表1 各组大鼠DAI、CMDI及TDI的比较Tab．1 Comparison of DAI，CMDI and TDI among the 6groups（±s）

与正常组比较，＊P＜0．01；与模型组比较，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；与TLR4mAb组比较，△P＜0．05；与LY294002组比较，＃P＜0．05。

组 别 例数DAI CMDI TDI正常组40 0 0 0模型组 39 9．86±2．49＊ 7．65±2．．23＊ 11．35±9．04＊TLR4mAb组 40 7．54±1．27▲ 5．70±1．85▲ 8．29±1．63▲LY294002组 39 7．59±4．60▲ 5．67±3．62▲ 8．26±5．47▲T＆L组 40 5．63±2．57▲▲△＃ 3．26±0．47▲▲△＃ 5．41±3．52▲▲△＃电针组 40 5．59±1．36▲▲△＃ 3．28±0．61▲▲△＃ 5．38±2．91▲▲△＃

图1 各组结肠组织的HE染色Fig．1 HE staining of rat colon tissues in the 6groups（×100）

2．2 电针对大鼠结肠组织TLR4mRNA、PI3KmRNA、P-AKT、活 化 NF-κB、TNF-α mRNA 及 IL-1β mRNA表达的影响 模型组结肠组织TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT、活化 NF-κB、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA较正常对照组显著增高 （P＜0．05 或 P＜0．01））；TLR4mAb 组TLR4mRNA表达较模型组明显下降（P＜0．01），LY294002组PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT低于模型组（P＜0．05或 P＜0．01），而在电针组和T＆L组 TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA及P-AKT表达均明显低于模型组（P＜0．05或P＜0．01）；与上述变化相对应，各治疗组活化 NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达均明显降低（P＜0．05或P＜0．01），电针组和T＆L组这3项指标优于TLR4mAb组和LY294002组，电针组与T＆L组在各项检测指标的比较中大体相当（P＞0．05），活化NF-κB与TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达呈正相关（r1＝0．579，P＜0．05；r2＝0．561，P＜0．05，图2、表2）。

3 讨 论

图2 各组结肠组织P-AKT、NF-κB、TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-αmRNA和IL-1β mRNA的表达Fig．2 Expressions of P-AKT，NF-κB，TLR4mRNA，PI3KmRNA，AKT mRNA，NF-κB mRNA，TNF-αmRNA and IL-1βmRNA in rat colon tissues in the 6groups

TNF-α是由单核巨噬细胞产生的一种细胞因子，具有广泛的生物学活性，除抗肿瘤外，对免疫反应、机体代谢、炎症反应均有重要的调节介导作用［10］。TNF-α参于UC致病作用主要是使中性粒细胞聚集、内皮细胞黏附分子表达上调及引起凝血酶原效应等。在肠道中介导黏膜损伤的作用，同时可刺激炎症细胞分泌其他细胞因子。如诱导产生血小板激活因子、白三稀等，使结肠固有膜内小血管在炎症基础上形成微血栓，导致黏膜微循环障碍。使肠黏膜组织损伤进一步加重。TNF-α可通过上述过程参与UC发病，为UC发病机制中的启动因子［11］。IL-1β是一种能激活多种免疫和炎症细胞的炎性细胞因子，其中IL-1B能促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达，趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，从而引起一系列肠道炎症反应和组织破坏［12］。NF-κB活化是众多炎症介质作用机制的共同通道，NF-кB广泛存在于静止期细胞的细胞质中其蛋白二聚体与特异性抑制蛋白IкB结合成三聚体，以非活化形式存在于细胞质中。当细胞受到如病毒或细菌感染、紫外线照射和感染前期细胞因子等作用刺激后，IкB发生磷酸化而失活，NF-кB进而活化，进入细胞核内，启动或调节早期反应基因的转录，如细胞因子、生长因子和急性期蛋白等，产生大量的包括TNF-α、IL-1β等炎症因子，另外，TNF-α等细胞因子也可以通过激活NF-κB诱导激酶（NIK）和丝裂原蛋白激酶的激酶1（MEKK1），从而使IKK磷酸化而激活，激活后的IKK再使IκB磷酸化，后者最后被蛋白酶降解，从而使NF-κB游离出来而活化，使信号进一步放大［13］。大量研究表明，NF-κB在 UC中高度表达并诱导TNF-α、IL-1β、IL-6大量表达在UC中发挥重要的作用［14］。研究显示，NF-κB抑制剂能显著减少结肠黏膜炎症细胞浸润，降低TNF-α、IL-6等细胞因子基因表达，有效改善结肠组织炎症反应，说明NF-κB在UC发生与发展中发挥重要枢纽作用。本研究发现，模型组NF-κB mRNA表达高于正常对照组（P＜0．05），提示NF-κB表达增高与UC发生有关，另本研究免疫印迹法测定法显示，在模型组大鼠结肠组织细胞核活化NF-κB表达增高的程度较正常组更为显著（P＜0．01），提示UC中不仅有NF-κB表达增强，更重要的是存在NF-κB激活。因此，本研究进一步证实NF-κB的异常表达与激活在UC发生中起重要作用。

表2 各组大鼠结肠组织TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT、NF-κB mRNA、活化 NF-κB、TNF-αmRNA及IL-1β mRNA表达的比较Tab．2 Comparison of TLR4mRNA，PI3KmRNA，AKT mRNA，P-AKT，NF-κB mRNA，active NF-κB，TNF-αmRNA and IL-1βmRNA expressions in colon tissues among the 6groups（±s）

表2 各组大鼠结肠组织TLR4mRNA、PI3KmRNA、AKT mRNA、P-AKT、NF-κB mRNA、活化 NF-κB、TNF-αmRNA及IL-1β mRNA表达的比较Tab．2 Comparison of TLR4mRNA，PI3KmRNA，AKT mRNA，P-AKT，NF-κB mRNA，active NF-κB，TNF-αmRNA and IL-1βmRNA expressions in colon tissues among the 6groups（±s）

与正常组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；与模型组比较，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；与 TLR4mAb比较，△P＜0．05，△△P＜0．01；与LY294002组比较，＃P＜0．05，＃＃P＜0．01。

组 别 n TLR4mRNA PI3KmRNA AKT mRNA P-AKT NF-κB mRNA 活化 NF-κB TNF-αmRNA IL-1βmRNA正常组 40 0．28±0．05 0．65±0．12 0．59±0．54 0．43±0．29 0．34±0．27 0．68±0．36 0．31±0．17 0．52±0．59模型组 39 1．37±0．32＊＊ 2．26±0．53＊＊ 1．16±0．47＊ 1．32±0．62＊＊ 0．59±0．24＊ 2．14±1．35＊＊ 0．97±0．32＊＊ 1．73±1．20＊＊TLR4mAb组 40 0．76±0．45▲▲ 2．25±0．62 1．15±1．06 1．35±1．07 0．51±0．28 1．42±0．93▲ 0．65±0．29▲ 1．29±0．81▲LY294002组 39 1．35±0．25 1．27±0．94▲▲ 0．78±0．68▲ 0．62±0．38▲▲ 0．52±0．20 1．40±0．85▲ 0．63±0．41▲ 1．31±0．34▲T＆L联合组 40 0．77±0．13▲▲＃＃ 1．28±0．25▲▲△△ 0．76±0．43▲△ 0．60±0．58▲▲△△ 0．45±0．15▲ 0．82±0．46▲▲△＃ 0．45±0．18▲▲△＃ 0．85±0．48▲▲△＃电针组 40 0．76±0．04▲▲＃＃ 1．29±0．27▲▲△△ 0．77±0．53▲△ 0．61±0．58▲▲△△ 0．43±0．05▲ 0．82±0．74▲▲△＃ 0．44±0．25▲▲△＃ 0．86±0．62▲▲△＃

TLR4是第一个被发现的Toll样受体，TLR4识别和摄取LPS后通过其下游MyD88依赖性及非依赖性信号转导通路来激活各种炎症因子。活化的Toll样受体的胞内结构域与MyD88羟基端相互作用使其活化，活化的MyD88可诱导IRAKs激酶磷酸化，进而激活胞质内的TRAF-6。活化后的TRAF-6通过TAK1与IKK信号级联，使1κB磷酸化而降解，最终激活 NF-κB［15］。活化后的NF-κB由胞质转移到细胞核内，引起促炎细胞因子基因的转录和表达，启动天然免疫和炎症反应有关基因的转录，诱发各种炎症反应。PI3K-Akt信号通路主要由 磷 脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，简称PKB或Akt）组成。PI3K是肌醇与磷脂酰肌醇的重要激酶，活化后可使肌醇环上的3位羟基磷酸化，使磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）转变为第二信使磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinosi-tol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）。AKT是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，PIP3与 AKt N端的pH 结构域（pleckstrin homology domain）结合，使AKT从细胞质转移到细胞膜上，并改变AKT的构象使之能被3-磷脂酰肌醇依赖型激酶1／2（3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1／2，PDK1／2）所磷酸化和激活［16］。NF-κB是AKT重要的下游效应子之一，AKT磷酸化使I-κK活化，促使I-κB降解，从而使NF-κB从复合物中解离并定位到细胞核中，恢复NF-κB的转录活性，启动靶基因转录［17］。TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信号通路是活化 NF-κB的两条重要途径，联合测定TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB能了解上述信号通路与疾病的关系，可作为疾病的诊断、预后和信号通路阻断治疗的一个有用指标。本研究结果显示，NF-κB活性、TNF-α、IL-1β与结肠组织TLR4／NF-κB和 PI3K／AKT／NF-κB含量呈同方向变化，这验证了 TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信号通路可能是NF-κB重要活化途径，所以可以说TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信号通路可通过直接或间接方式在UC发生、发展中发挥着重要作用。提示通过阻断 TLR4／NF-κB 和 PI3K／AKT／NF-κB 通 路、抑 制NF-κB活化进而下调TNF-α、IL-1β表达是有效改善结肠黏膜炎症损伤的一个重要途径。

中医理论认为疾病状态下，经络会出现血气阴阳偏盛的虚实征候，针刺穴位可激发经络本身协调阴阳的功能，泄其有余，补其不足，阴阳平复，达到调整虚实防治疾病的作用。现代研究表明，神经内分泌系统与免疫系统之间有密切的双向调节联系。免疫细胞上有多种神经内分泌激素受体，多种激素会影响免疫功能，免疫细胞也可合成神经递质和激素影响内分泌系统，神经-内分泌-免疫系统紊乱参与UC发病。针刺可影响神经内分泌激素和细胞因子的生成和表达，双向调节神经一内分泌一免疫网络，使异常机能向有利于机体的方向转化。有研究表明，针灸对提高免疫系统机能的调整功能是扶正的物质基础，又是除邪的物质条件，表明针灸“补虚泻实 扶正祛邪”的理论是科学的，其调整功能是可靠的。足三里穴是足阳明经合穴，为土中之土穴，回阳针穴之一，是强壮要穴和肚腹疾患之常用穴，针刺足三里穴所产生的信号是通过腓深神经和胫前动脉壁上的神经丛上传的，其传入冲动在脊神经节、脊髓背角、延髓等不同中枢水平与胃肠等内脏器官的感觉传入汇聚，使足三里穴、胃肠经穴、脏腑之间建立特异的相互联系。现代研究证实，足三里可调节机体免疫功能、调整胃肠功能、调整肠道内环境而达到治疗目的。本研究结果显示，模型组结肠组织中 TLR4mRNA、PI3KmRNA、P-AKT、活化 NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA 表达及大鼠DAI、CMDI及 TDI显著增加（P＜0．01）。这提示UC发生时机体 TLR4／NF-κB 和 PI3K／AKT／NF-κB信号通路表达增强，能激活NF-κB，活化的 NF-κB可通过上调TNF-α、IL-1β的表达参与参与UC的发生、发展。与模型组比较，各治疗组大鼠结肠组织活化 NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA 表达及大鼠DAI、CMDI及 TDI显著降低（P＜0．01或P＜0．05），以T-L联合组和电针组更为显著（P＜0．01），同时在TLR4mAb组大鼠结肠组织TLR4mRNA明显下降（P＜0．01），在LY294002组大鼠结肠组织PI3KmRNA、P-AKT明显下降（P＜0．01），T-L联合组TLR4mRNA和PI3KmRNA、P-AKT均明显下降。这说明TLR4mAb和LY294002可分别以阻断TLR4／NF-κB和PI3K／AKT／NF-κB信号通路来抑 制 NF-κB 的 活 化，下 调 TNF-αmRNA、IL-1βmRNA促炎细胞因子的表达、调节免疫反应，减少炎症递质的释放，从而有效阻断免疫反应性对机体造成的损伤，达到预防UC的目的。两者联用时有协同作用。另本研究结果显示，电针对UC大鼠上述各指标的抑制程度与T-L联合组相当，这提示阻断TLR4／NF-κB和 PI3K／AKT／NF-κB 两 通 路、抑 制NF-κB活化、下调炎症因子是电针治疗UC的重要机制，为临床电针治疗UC提供了理论和实验依据。

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