用细胞学方法评价10种抗生素的寒热药性

2015-02-18王思文刘建利

西安交通大学学报（医学版） 2015年3期

王思文，刘建利

（西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西北大学生命科学学院，陕西西安 710069）

“西药中药化”［1］不仅可以扩大中药品种，而且中药化了的西药具有中药和西药的双重优势，不仅具有西药成分明确、质量可控，作用靶点清楚等特点，也具有中药的性质，可以在中医理论指导下辨证用药，必将提高临床治疗效果。西药中药化的研究方法主要是通过临床观察、总结获得西药的中药属性。已经对阿托品［2］、利血平［3］、头孢菌素［4-5］、吲达帕胺（寿比山）［6］、吗丁啉［7］、氨茶碱［8］等进行了研究。结果证明西药确可具有中药特性，进行西药中药化研究是可行的。通过临床观察研究西药中药化的主要难点在于，其一使用西药的主要是西医，他们大部分人不懂或者对西药中药化不感兴趣。其二，西药临床用药时常多种药物配合使用，这样难以区分每个药的中药属性。虽然西药中药化研究进行了三十多年，也只有极少数的西药被赋予了中药的药性。因此，不难看出限制西药中药化进程的主要原因是缺乏相对应的实验方法。如果有了实验方法将会大大加快西药中药化研究的进程。本文用细胞学方法评价西药抗生素的寒热药性，为西药中药化研究提供实验方法，促进西药中药化的进程。

1 材料与方法

1．1 实验材料仪器：CO2培养箱（Sanyo公司）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、Quant酶标仪（美国Bio-Tek）、细胞96孔培养板与普通倒置光学显微镜。

药品与试剂：10种抗生素：氨苄西林（珠海联邦制药股份有限公司中山分公司）、头孢克肟片（江苏正大清江制药有限公司）、头孢泊肟酯片（重庆科瑞制药有限公司）、头孢氨苄胶囊（石药集团欧意药业有限公司）、头孢克洛片（石药集团欧意药业有限公司）、阿奇霉素片（石药集团欧意药业有限公司）、克拉霉素片（宜昌长江药业有限公司）、罗红霉素（北京康蒂尼药业有限公司）、土霉素片（西安利君制药有限责任公司）、盐酸多西环素（陕西西岳制药有限公司）。试剂：HyClone改良型RPMI-1640培养液（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、DMSO（二甲基亚砜）、磷酸缓冲液（PBS）、MTT（Simga公司）、2．5g／L胰蛋白酶（西安舟鼎国生物技术有限公司）。

1．2 细胞株由第四军医大学提供的人肝癌细胞株SMMC7721以及人乳腺癌细胞MCF-7。

1．3 受试药品溶液的制备将所选药物分别碾成粉末，有糖衣的需先刮去糖衣，再分别称取20mg，将其溶解于1mL DMSO中，制成20mg／mL的储备液。再用DMSO逐级稀释至各个待用浓度，于常温保存。

1．4 实验方法

1．4．1 确定药物浓度范围将各药物20mg／mL的储备液都稀释为16个浓度梯度，通过多次预实验进行浓度筛选，实验发现当药物终浓度低于0．1μg／mL时，多数药物对细胞的增殖没有显著影响，而当浓度高于100μg／mL时，所有药物均表现为抑制细胞的增殖。故而将药物浓度范围定在0．1～100μg／mL之间，从中选择8个浓度梯度，使其加入细胞后的终浓度分别为0．1、0．5、1、5、10、20、50、100μg／mL。

1．4．2 MTT法分别取对数生长期的两种细胞，将它们的细胞密度都调整为5×107／L并接种于96孔板上，加入培养基培养24h待细胞贴壁。更换新鲜培养基（198μL／孔），同时实验组每孔加2μL的药液，对照组加2μL的DMSO，每个加样组均设置3个平行孔。加药完毕后，置于培养箱中培养48h，更换新鲜培养基（180μL／孔），并加入新鲜配制的 MTT溶液（20μL／孔），继续培养4h后，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO后震荡，用酶联免疫标定仪测定490nm处吸光值。细胞抑制率的计算公式为：细胞抑制率＝（1-实验组A值／对照组A值）×100%，抑制率为正值时表示为抑制细胞的生长增殖，负值时则为促进细胞的增殖，实验重复3次。

2 结果

2．1 10种抗生素对细胞增殖率的影响加药培养48h后用MTT法分别检测10种抗生素在0．1～100 μg／mL浓度范围内对SMMC7721细胞体外生长增殖的影响，所得实验数据通过t检验处理后如表1至表3所示。

表1 抗生素氨苄西林、头孢氨苄、头孢克肟、头孢克洛对SMMC7721细胞体外增殖的影响Tab．1 Effects of antibacterial drugs ampicillin，cefalexin，cefixime and cefaclor on the proliferation of SMMC7721cells in vitro（±s）

与对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

质量浓度（μg／mL）氨苄西林A值抑制率（%）头孢氨苄A值抑制率（%）头孢克肟A值抑制率（%）头孢克洛A值抑制率（%）0．1 0．209±0．003 3．69 0．324±0．004＊＊ 11．48 0．210±0．002 3．23 0．326±0．004＊＊10．93 0．5 0．191±0．004＊ 11．98 0．293±0．005＊＊ 19．95 0．205±0．003＊ 5．23 0．321±0．003＊＊ 12．30 1 0．181±0．004＊＊ 16．59 0．287±0．005＊＊ 21．85 0．193±0．005＊ 11．06 0．311±0．005＊＊ 15．03 5 0．177±0．005＊＊ 18．43 0．236±0．005＊＊ 35．52 0．184±0．005＊＊ 15．21 0．284±0．004＊＊ 22．40 10 0．161±0．006＊＊ 25．81 0．239±0．006＊＊ 34．70 0．153±0．004＊＊ 29．49 0．275±0．004＊＊ 24．86 20 0．143±0．004＊＊ 34．10 0．214±0．005＊＊ 41．53 0．141±0．003＊＊ 35．02 0．258±0．003＊＊ 29．51 50 0．127±0．005＊＊ 41．47 0．195±0．004＊＊ 46．72 0．133±0．005＊＊ 38．71 0．241±0．004＊＊ 34．15 100 0．117±0．005＊＊ 46．02 0．171±0．006＊＊ 53．28 0．124±0．003＊＊ 42．56 0．235±0．005＊＊ 35．79对照组 0．217±0．005 - 0．336±0．004 - 0．217±0．005 - 0．336±0．004-

表2 抗生素头孢泊肟酯、土霉素、多西环素对SMMC7721细胞体外增殖的影响Tab．2 Effects of antibacterial drugs cefpodoxime proxetil，oxytetracycline and doxycycline on the proliferation of SMMC7721 cells in vitro（±s）

与对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

质量浓度（μg／mL）头孢泊肟酯A值抑制率（%）土霉素A值抑制率（%）多西环素A值抑制率（%）0．1 0．344±0．005＊ 6．01 0．316±0．005＊＊ 11．98 0．403±0．005＊＊19．24 0．5 0．329±0．005＊＊ 10．11 0．239±0．004＊＊ 18．38 0．296±0．005＊＊ 40．68 1 0．319±0．003＊＊ 12．84 0．300±0．003＊＊ 16．43 0．342±0．005＊＊ 31．46 5 0．306±0．004＊＊ 16．39 0．244±0．009＊＊ 32．03 0．217±0．005＊＊ 56．51 10 0．289±0．004＊＊ 21．04 0．239±0．003＊＊ 33．43 0．103±0．002＊＊ 79．36 20 0．273±0．004＊＊ 25．41 0．192±0．005＊＊ 46．52 0．104±0．003＊＊ 79．16 50 0．265±0．004＊＊ 27．60 0．153±0．004＊＊ 57．38 0．102±0．004＊＊ 79．56 100 0．211±0．004＊＊ 42．35 0．090±0．004＊＊ 74．93 0．104±0．004＊＊ 79．16对照组 0．336±0．004 - 0．359±0．005 - 0．499±0．06-

表3 抗生素阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素对SMMC7721细胞体外增殖的影响Tab．3 Effects of antibacterial drugs azithromycin，roxithromycin and clarithromycin on the proliferation of SMMC7721cells in vitro（±s）

与对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

质量浓度（μg／mL）阿奇霉素A值抑制率（%）罗红霉素A值抑制率（%）克拉霉素A值抑制率（%）0．1 0．408±0．004＊＊ 7．06 0．427±0．002＊ 2．73 0．408±0．003＊＊7．06 0．5 0．374±0．003＊＊ 14．81 0．415±0．003＊＊ 5．47 0．400±0．004＊＊ 8．88 1 0．368±0．002＊＊ 16．17 0．407±0．003＊＊ 7．29 0．329±0．003＊＊ 25．06 5 0．333±0．005＊＊ 24．83 0．411±0．003＊＊ 6．38 0．322±0．004＊＊ 26．65 10 0．349±0．001＊＊ 20．50 0．353±0．003＊＊ 19．59 0．316±0．003＊＊ 28．02 20 0．325±0．002＊＊ 25．97 0．295±0．004＊＊ 32．80 0．264±0．004＊＊ 39．86 50 0．291±0．004＊＊ 33．71 0．236±0．004＊＊ 46．24 0．245±0．005＊＊ 44．19 100 0．212±0．005＊＊ 51．71 0．197±0．005＊＊ 55．13 0．199±0．003＊＊ 54．67对照组 0．439±0．005 - 0．439±0．005 - 0．439±0．005-

通过表1～表3的数据可以看出这10种抗生素在该浓度范围内对SMMC7721细胞的生长抑制率都为正值，说明这些药在整个浓度范围内都抑制细胞的生长，并有明显的浓度依赖关系，即随着浓度的增大抑制作用也随之增强，故判定它们的药性为寒性。

同样，用MTT法检测10种抗生素在0．1～100 μg／mL浓度范围内对MCF-7细胞体外生长增殖的影响，所得实验数据通过t检验处理后如表4～表6所示。

表4 抗菌药氨苄西林、头孢氨苄、头孢克肟、头孢克洛对MCF-7细胞体外增殖的影响Tab．4 Effects of antibacterial drugs ampicillin，cefalexin，cefixime and cefaclor on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

与对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

质量浓度（μg／mL）氨苄西林A值抑制率（%）头孢氨苄A值抑制率（%）头孢克肟A值抑制率（%）头孢克洛A值抑制率（%）0．1 0．213±0．004＊ 9．36 0．205±0．005 2．84 0．224±0．004＊4．69 0．201±0．006 4．74 0．5 0．203±0．005＊＊ 13．62 0．194±0．006＊ 8．06 0．207±0．005＊＊ 11．91 0．194±0．006＊ 8．06 1 0．184±0．005＊＊ 21．70 0．182±0．004＊＊ 13．74 0．198±0．004＊＊ 15．74 0．178±0．003＊＊ 15．64 5 0．185±0．005＊＊ 21．28 0．177±0．004＊＊ 16．11 0．173±0．003＊＊ 26．38 0．172±0．005＊＊ 18．48 10 0．162±0．005＊＊ 31．06 0．162±0．006＊＊ 23．22 0．159±0．005＊＊ 32．34 0．163±0．006＊＊ 22．75 20 0．134±0．004＊＊ 42．98 0．165±0．004＊＊ 21．80 0．144±0．006＊＊ 38．72 0．142±0．005＊＊ 32．70 50 0．121±0．004＊＊ 48．51 0．145±0．005＊＊ 31．28 0．126±0．004＊＊ 46．38 0．114±0．004＊＊ 45．97 100 0．111±0．005＊＊ 52．77 0．121±0．005＊＊ 42．65 0．114±0．005＊＊ 51．49 0．109±0．003＊＊ 48．34对照组 0．235±0．005 - 0．211±0．002 - 0．235±0．005 - 0．211±0．002 -

表5 抗生素头孢泊肟酯、土霉素、多西环素对MCF-7细胞体外增殖的影响Tab．5 Effects of antibacterial drugs cefpodoxime proxetil，oxytetracycline anddoxycycline on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

与对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

质量浓度（μg／mL）头孢泊肟酯A值抑制率（%）土霉素A值抑制率（%）多西环素A值抑制率（%）0．1 0．202±0．005 4．27 0．345±0．003＊＊ 13．32 0．374±0．002＊＊12．62 0．5 0．193±0．003＊＊ 8．53 0．339±0．006＊＊ 14．82 0．344±0．002＊＊ 19．63 1 0．189±0．006＊ 10．43 0．361±0．004＊＊ 9．30 0．311±0．003＊＊ 27．34 5 0．179±0．006＊＊ 15．17 0．329±0．003＊＊ 17．34 0．295±0．002＊＊ 31．07 10 0．154±0．006＊＊ 27．01 0．235±0．006＊＊ 40．95 0．219±0．003＊＊ 48．83 20 0．145±0．004＊＊ 31．28 0．207±0．003＊＊ 47．99 0．233±0．002＊＊ 45．56 50 0．148±0．005＊＊ 29．86 0．184±0．003＊＊ 53．77 0．187±0．002＊＊ 56．31 100 0．117±0．005＊＊ 44．55 0．162±0．006＊＊ 59．30 0．155±0．003＊＊ 63．79对照组 0．211±0．002 - 0．398±0．006 - 0．428±0．004-

表6 抗生素阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素对MCF-7细胞体外增殖的影响Tab．6 Effects of antibacterial drugs azithromycin，roxithromycin and clarithromycin on the proliferation of MCF-7cells in vitro（±s）

与对照组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

质量浓度（μg／mL）阿奇霉素A值抑制率（%）罗红霉素A值抑制率（%）克拉霉素A值抑制率（%）0．1 0．338±0．004 0．88 0．322±0．003＊＊5．57 0．332±0．005 2．64 0．5 0．318±0．004＊＊ 6．74 0．313±0．003＊＊ 8．21 0．335±0．004 1．76 1 0．275±0．005＊＊ 19．35 0．285±0．004＊＊ 16．42 0．309±0．002＊＊ 9．38 5 0．226±0．003＊＊ 33．72 0．288±0．005＊＊ 15．54 0．285±0．003＊＊ 16．42 10 0．205±0．003＊＊ 39．88 0．245±0．003＊＊ 28．15 0．159±0．003＊＊ 53．37 20 0．181±0．006＊＊ 46．92 0．204±0．003＊＊ 40．18 0．138±0．003＊＊ 59．53 50 0．158±0．004＊＊ 53．67 0．159±0．005＊＊ 53．37 0．121±0．003＊＊ 64．52 100 0．149±0．005＊＊ 56．30 0．125±0．004＊＊ 63．34 0．102±0．002＊＊ 70．09对照组 0．341±0．004 - 0．341±0．004-0．341±0．004 -

通过表4～表6的数据可以看出10种抗生素在该浓度范围内对MCF-7细胞的生长抑制率都为正值，说明这些药物在整个浓度范围内都抑制细胞的生长，并有明显的浓度依赖关系，即随着浓度的增大，抑制率逐渐增大，抑制作用增强，因而认为这10种抗生素的药性为寒性。

2．2 10种抗生素对SMMC7721细胞以及MCF-7细胞形态的影响选取6种抗生素在最大浓度时（100 μg／mL），对SMMC7721细胞以及 MFC-7细胞抑制效果的照片，并和空白组与对照组比较。照片放大倍数均为100倍，分别如图1及图2所示。

图2 所选抗生素对MCF-7细胞形态及密度的影响Fig．2 Effects of the selected antibacterial drugs on the shape and density of MCF-7cells

通过图1及图2可以看出，正常的SMMC7721细胞在倒置显微镜下观察，其形态呈不规则多边形，颗粒较大且堆积生长；而MCF-7细胞呈狭长状，颗粒较小，致密。分别与空白组及对照组比较，发现以上抗生素均能抑制细胞生长，使得细胞密度均明显降低，且细胞间结构松散，细胞颗粒感增强。

3 讨论

中药最重要的药性当属寒热，《神农本草经》中曾有记载，“疗寒以热药”，“疗热以寒药”。古代中医名家陶弘景说“药物甘苦之味可略，唯冷热须明”。那么，西药中药化研究首先要搞清楚的也应该是寒热属性，至于五味、归经、配伍等可在以后的临床使用中补充。传统上中药寒热药性是通过人体对临床用药的反应总结获得的。近年来，研究者应用基因组学技术［9］、红外成像原理［10］、生物热动力学技术等［11］对中药寒热性进行研究，建立了动物实验［12-13］、微量热法［14-15］、红外扫描［16］、冷热板示差［17］、细胞学（MTT法）［18］等方法研究中药寒热药性。对于离体培养的细胞，热药促进其生长增殖，寒药抑制，说明细胞学方法评价中药寒热药性是切实可行的，且具有简便、快速、重现性好等诸多优点。把它用于西药寒热属性的评价也应该可行。

现代西药高度发达、品种繁多，而且每年还有数十种新药上市。如果能够把西药纳入中药的范畴应用，无疑会迎来中药的大发展。西药中药化的障碍是缺乏简便、可靠的实验方法，只是依靠临床总结，所以进展缓慢。我们所建立的细胞学方法评价寒热药性经过数十种公认寒热药性中药检验是可靠的。推广应用于西药寒热药性的评价必将促进西药中药化的进程。本文结果显示这种尝试是成功的。

药物作用于细胞可能会促进细胞的生长，也可能会抑制。以往对公认寒热性中药的验证实验表明促进表示热性，而抑制表示寒性。但也有例外，如附子公认为大热之药，而对细胞则表现为抑制。后来经过反复实验验证发现热性太强也会表现为抑制，但这种抑制当将浓度再稀释时就会变为促进。即部分热药它们浓度大时表现为抑制，而浓度小时则表现为促进。

本文对10种抗生素进行了寒热药性的初步评价，该结果与乔福渠［5］总结的氨苄西林、头孢菌素、红霉素、土霉素等抗菌药为寒性的结果一致。从临床用药情况看抗生素主要针对热证患者，其药性理应属于寒性。

西药中药化不仅有利于中药品种和使用范围的扩大，也对于西医或者患者使用西药有很强的指导意义。例如，可根据患者的体质来选择相应的药物，寒性体质的患者适宜热性药物，反之亦然。由于大部分抗生素显示寒性，遇到寒性体质可供选择的热性抗生素非常有限，这时可以考虑配伍其他热药，这样将提高药物的临床效果，减少副作用。虽然完整的中医辨证需要很有经验的中医师，但简单的寒热辨证对具有中国文化背景的人都应该不难。因此，了解西药寒热药性将是非常有用的，结果对临床用药也很有意义。

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