不同养殖时期刺参肠道内菌群结构的分析

王姣姣，李丹，王轶南，王俊杰，刘艳萍，常亚青

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023)

刺参Apostichopus japonicus是中国重要的海水养殖种类，养殖区域分布于辽宁、山东和河北等地沿海，具有巨大的经济效益和社会效益［1］。动物肠道内的菌群是肠道的重要组成部分，水生动物的肠道菌群与宿主以及所处的水生环境存在相互依赖和相互制约的关系，对营养物质的消化、吸收等方面具有重要作用［2］。刺参营底栖生活并以沉积物为食，细菌在刺参的食物中占据较大的比例［3］，刺参肠道内细菌群落组成直接受到养殖环境中菌群变化的影响［4］。目前，有关刺参肠道内细菌群落的研究报道已有不少，张文姬等［5］分析了刺参肠道内可培养微生物的种类，杨志平等［6］利用点种法筛选和鉴定了刺参潜在产酶益生菌。但是由于在自然界中85%～99%的细菌不可分离培养，传统细菌分离方法难以全面反映刺参肠道内细菌群落组成的情况［7］，丁君等［8］利用 PCR-DGGE 技术分析了刺参肠道内的细菌种类。分子技术在刺参肠道菌群研究中的应用，为深入了解刺参肠道内的菌群组成提供了帮助，李彬等［4］运用传统细菌分离培养技术与分子生物学技术相结合的方法，对刺参肠道内的细菌菌群进行了分析。现已开展的研究主要集中在刺参肠道细菌种类的分析，而关于刺参肠道菌群季节性变化的研究却鲜有报道。有关水产养殖动物消化道菌群季节性变化的研究已引起重视［9-10］。本研究中，应用PCR-DGGE技术对不同养殖时期刺参肠道内的细菌群落进行了分析，探讨其演替规律，以期为深入了解刺参肠道菌群结构和刺参肠道微生态研究提供更为详尽的资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用刺参采自辽宁省大连市瓦房店仙峪湾养殖场。

1.2 方法

1．2．1 样品采集 每次采集9头健康的2龄刺参(约100 g)，采样时间为2009年6月、2009年9月、2009年 10月、2010年 3月、2010年 4月、2010年5月，置于冰盒中带回实验室，在无菌条件下解剖刺参，取肠道内含物混合后于-20℃下保存［11］。按采样时间将样品编为WI6、WI9、WI10、WI3、WI4、WI5号。

1．2．2 DNA提取 将刺参肠道内含物样品与Tris-HCl buffer、超纯水和Al2(SO4)3涡旋混匀后，用NaOH调pH至8，离心，弃上清，置于冰箱 (-20℃)中保存备用。利用溶菌酶法［12］进行粗提，再利用苯酚抽提法［13］进行提取，作为PCR反应的模板，于-20℃下保存备用。

1．2．3 细菌16S rDNA-V3可变区域的 PCR扩增采用特异性引物:F341(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG)和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG)，并在F341的5'端加入一段长为40 bp的富含 GC的 片 段(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG-GCACGGGGGG)［14-15］，对细菌16S rDNA基因V3可变区PCR后［12］，产物于4℃下保存备用。

1．2．4 变性梯度凝胶电泳及分析 采用 D-Code System(Bio-Rad)按下列条件进行:8%的聚丙烯酰胺，变性剂浓度为30%～60%，电压为75 V，温度为60℃，电泳时间为12 h。用SYBR-Green I染色，经UVP凝胶系统成像后，采用凝胶分析软件Quantity One对DGGE图谱各样品条带的迁移率、灰度和数量进行数字化处理，然后进行多样性和相似性分析［16］。

1．2．5 DGGE条带的测序分析 在紫外灯下对DGGE凝胶中主要条带 (优势条带、共有条带等具有代表性的特殊条带)切割、回收并扩增。经纯化后的PCR产物连接到载体pMD19-T中，采用T载体通用引物M13进行菌落PCR，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测是否为阳性克隆，将阳性克隆对应的白色转化子于含有Amp的LB液体培养基中过夜培养 (37℃)，进行质粒提取。取上述质粒5 μL经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有质粒DNA。克隆过程中每个条带选择多个转化子，确保每个条带达到3～5个阳性克隆。将回收质粒交由宝生物工程(大连)有限公司测序。测序获得的序列在NCBI的GenBank数据库中进行Blast同源性比较(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast/)。

2 结果与分析

2.1 不同养殖时期刺参肠道内菌群DGGE图谱的构建与分析

图1 刺参肠道菌群16S rDNA-V3可变区PCR-DGGE图谱Fig.1 PCR-DGGE profiles of the 16S rDNA V3 region of the bacterial flora in intestines of sea cucumber Apostichopus japonicus

不同养殖时期刺参肠道内菌群的16S rDNAV3可变区片段的变性梯度凝胶电泳指纹图谱见图1-A，3月 (WI3)、4月 (WI4)、5月 (WI5)、6月 (WI6)、9月 (WI9)、10月 (WI10)的条带数目分别为49、49、54、53、52、51。运用Quantity One软件，以5月份为标准构建模式图谱 (图1-B)，分析出3月、4月、5月、6月、9月和10月6个不同时期刺参肠道内菌群结构的相似性结果(表1)。从表1可见，WI3和WI9的菌群结构相似度最高，为 67．9%，WI4与 WI10次之，为63．8%，WI3与WI6的菌群结构相似度最小，为21．6%。刺参肠道各样品的多样性指数均在2．0左右，均匀度为 0．20～0．24，差异不明显 (表 2)。经UPGMA聚类分析 (图2)表明，WI3和WI9聚为一支，WI4和WI10聚为另一支。

表1 刺参肠道内菌群的相似性矩阵图Tab 1 Similarity matrix of DGGE patterns in bacterial flora in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus %

表2 刺参肠道内菌群的多样性指数、均匀度和丰富度Tab 2 Shannon-Wiener index(H)，evenness(EH)and richness(S)of the bacterial flora in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus

图2 PCR-DGGE图谱聚类分析Fig.2 Cluster analysis of PCR-DGGE

2.2 刺参肠道内菌群的结构及变化

对不同位置刺参肠道内含物图谱条带进行切胶回收，由主要条带示意图 (图1-C)可知，3月、4月、5月、6月、9月、10月样品的可切胶回收条带数分别为18、17、20、14、16、14条。序列通过NCBI中BLAST进行同源性比对分析 (表3)，11个条带与未培养菌同源性达到98%以上，其余32个条带明确分类的菌种与7个细菌类群相似，其中 7条序列 (AgcW20、AgcW23、AgcW28、AgcW31、AgcW34、AgcW37、AgcW42)与 α-变形菌纲Alpha proteobacteria相似，18条序列 (Agc W02、 AgcW03、 AgcW04、 AgcW08、 AgcW09、AgcW10、AgcW12、AgcW13、AgcW14、AgcW16、AgcW19、AgcW21、AgcW30、AgcW32、AgcW33、AgcW35、AgcW36、AgcW41)与γ-变形菌纲Gamma proteobacteria相似，1条序列 (AgcW17)与δ-变形菌纲 Delta proteobacteria相似，3条序列(AgcW15、AgcW26、AgcW39)与黄杆菌纲 Flavobacteria相似，1条序列 (AgcW01)与蓝藻纲Cyanobacteria相似，1条序列 (AgcW05)与绿弯菌门Chloroflexi相似，1条序列 (AgcW06)与疣微菌门Verrucomicrobia相似。各时期存在一些共有条带，如 AgcW05、AgcW25、AgcW26、AgcW27、AgcW29、AgcW30、AgcW39、AgcW40、AgcW42、AgcW43。 其 中， AgcW25、 AgcW27、 AgcW29、AgcW40、AgcW43号条带为未培养细菌。

对克隆得到的序列进行统计分析，得到不同月份刺参肠道内细菌的群落组成 (图3)。不同月份刺参肠道内细菌群落均包含α-变形菌纲、γ-变形菌纲、黄杆菌纲，但相对含量各不相同。在3月份时，γ-变形菌纲 (27．78%)＞α-变形菌纲(22．22%)＞黄杆菌纲 (11．11%);在 4月份时，γ-变形菌纲 (29．41%)＞黄杆菌纲 (11．76%)=α-变形菌纲 (11．76%);在5月份时，γ-变形菌纲 (30．00%)＞α-变形菌纲 (10．00%)=黄杆菌纲 (10．00%);在 6月份时，γ-变形菌纲(35．71%)＞黄杆菌纲 (21．42%)＞α-变形菌纲(7．14%);在9月份时，γ-变形菌纲(25．00%)＞α-变形菌纲 (18．75%)＞黄杆菌纲 (12．50%);在10月份时，γ-变形菌纲 (35．71%)＞黄杆菌纲(14．28%)= α-变形菌纲 (14．28%)。不同月份刺参肠道内的优势菌群均为γ-变形菌纲。

3 讨论

刺参营底栖生活，摄食无选择性［17］，多以沉积物为食，摄入大量的底泥、有机物质和细菌，肠道的菌群结构与底泥较为相近［18］，并且刺参的肠道中存在定植菌群辅助消化［19］。与此一致，不同

时期刺参肠道内细菌16S rDNA-V3序列DGGE图谱包含50个左右的可见条带，表明刺参肠道内均存在丰富菌群。高菲等［20］利用PCR-DGGE技术研究了刺参肠道内的细菌群落组成，共得到13条序列，将其归类于α-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲、拟杆菌纲和柔膜菌纲等5大类群，γ-变形菌纲为其优势菌群。李彬等［4］所认定的刺参肠道内8株优势菌中，有7株菌属于变形菌门的γ-变形菌纲。Huaide等［21］研究显示，中国对虾Fenneropenaeus chinensis肠道内的优势菌也属于γ-变形菌纲。本研究中，在不同养殖时期共获得43个主要的DGGE条带序列，获得的条带数量较多，可较全面地反映刺参肠道内的菌群结构。除未培养菌外，获得的条带序列可归属为α-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲、黄杆菌纲、蓝藻纲、绿弯菌门、疣微菌门7个细菌类群，其中优势菌群为γ-变形菌纲，与以上研究学者得出的结论相同。然而，本研究中获得了与黄杆菌纲、蓝藻纲、绿弯菌门、疣微菌门等菌种相似的条带，与高菲等［20］的研究存在差异，这可能与样品来源不同有关。

表3 刺参肠道内细菌PCR-DGGE代表条带的测序结果Tab 3 Sequencing results of PCR-DGGE bands in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus

图3 不同养殖月份刺参肠道内细菌群落组成Fig.3 Bacterial flora in gut contents of sea cucumber Apostichopus japonicus in different culture months

受水温影响，刺参的摄食和生理活动在周年养殖期内存在2个升降周期［22］。冬季冰封期，水温较低，刺参摄食量减少，处于半休眠状态;春季随水温回升，刺参摄食量增加进入快速生长期;进入6月下旬，海水温度上升，刺参活动减弱，摄食量又下降，当水温超过21℃时刺参则进入夏眠，夏眠期间，刺参的肠道衰竭、停止摄食、基础代谢下降，黄、渤海区刺参的夏眠期大约可持续100 d左右［3］;秋季水温下降后，刺参结束夏眠，生长出新的肠道并重新运动和觅食，进入第二个生长期。本研究中，采集养殖刺参的肠道内容物时间段为3月—6月和9月—10月，基本涵盖了刺参两个摄食旺盛的时期。本研究中结果显示，不同时期刺参肠道内菌群中均存在α-变形菌纲、γ-变形菌纲和黄杆菌纲，但不同时期其相对含量不同，除3月和9月外，黄杆菌纲的相对含量均高于α-变形菌纲。3月至4月，α-变形菌纲所占比例急剧下降，由22．22%下降至 11．76%，之后两个月均未超过10%。与此同时，γ-变形菌纲所占比例逐渐上升，由27．78%(3月)上升至35．71%(6月);黄杆菌纲所占比例前期较稳定，6月明显提高。表明3月至6月刺参肠道内菌群结构变化较大，且呈现出明显的演替变化规律，即α-变形菌纲下降，而γ-变形菌纲与黄杆菌纲比例上升。9月至10月期间菌群结构发生了与此相似的变化趋势，其中γ-变形菌纲所占比例由25．00%升至35．71%。现有研究发现，栉孔扇贝［9］、草鱼［10］等消化道内细菌的群落组成相对稳定，细菌多样性季节变化并不明显。本研究中，得出的结果与之不同。推测刺参肠道内菌群结构的季节性变化可能与刺参的摄食和生理活动特点有关，在刺参由摄食停止或较弱状态发展至摄食旺盛状态的过程中，刺参肠道内菌群结构呈规律性演替，并且在两个摄食旺盛生长快速的时期都表现出类似的过程。春秋两季刺参肠道内菌群结构经历类似的变化，聚类分析显示，3月和9月的菌群结构相似，而4月和10月的菌群结构相似，结果也与此一致。此外，刺参肠道细菌菌群平衡破坏易引发疾病［23］，肠道菌群结构的这种变化也可能是春秋季节疾病多发的原因之一。

刺参肠道内存在一定量的潜在致病菌，其与肠道内的其他细菌形成平衡的菌群系统，仅在特定条件下大量增殖并使刺参患病。李彬等［4］研究发现，正常刺参肠道中存在可引起刺参腐皮综合征的灿烂弧菌，而刺参肠道内还存在对致病灿烂弧菌具有拮抗作用的微生物［24］。本研究中，3月和6月在刺参肠道中亦发现灿烂弧菌，除3月外，不同时期肠道内均存在Tenacibaculum sp．，且为优势条带。根据张莹等［25］的发现，腐皮综合征刺参病灶处存在优势菌Tenacibaculum sp．，推测其可能亦为刺参肠道内的潜在致病菌。

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