新型苯并噻唑衍生物YLT322诱导结直肠癌细胞的凋亡作用及机制研究

易晓红，宋雪皎，贺玉萍，高添桃，雷倩，余洛汀

·药理毒理·

新型苯并噻唑衍生物YLT322诱导结直肠癌细胞的凋亡作用及机制研究

易晓红1,2，宋雪皎1，贺玉萍2，高添桃1，雷倩1，余洛汀1

目的：YLT-322是本实验室合成的一种新型的苯并噻唑衍生物,已有文献证实其可以通过线粒体途径诱导肝癌细胞HepG2凋亡,对多种癌细胞都有效果。本实验拟通过一系列生物实验来考察YLT-322对结直肠癌细胞的作用。方法：作者对多种癌细胞进行初筛,筛选出两种效果较好的结直肠癌细胞进行细胞毒性试验,平板克隆形成,Hoechst等实验,以证实YLT-322对结直肠癌有良好的抑制作用。结果：YLT-322实验组比对照组的细胞凋亡明显增多，且与剂量和作用时间成正比。说明YLT-322的确对结直肠癌有抑制作用。结论：YLT-322对结直肠癌细胞有诱导凋亡的作用，作为一个新型的小分子抑癌药物,具有很大的开发价值。

苯并噻唑衍生物；YL-T322；结直肠癌；凋亡；细胞毒性试验；平板克隆；Hoechst

目前,据世界卫生组织统计,结直肠癌已成为世界男性第三位、女性第二位高发的恶性肿瘤。近年来，中国的结直肠癌发病率呈上升趋势，增长速度迅猛，中国已经是绝对数和相对数都高发的结直肠癌大国。目前临床上用于治疗晚期癌症的化疗药物常为传统的细胞毒类化疗药物，总体上效果不佳，且毒副作用较大。因此，发现新型抗肿瘤药物迫在眉睫。苯并噻吩及其衍生物是一类重要的有机合成中间体，尤其是衍生物具有多种生物活性，在医药领域有很重要的作用。近年来，其抑癌作用得到越来越多的关注。YLT322是本实验室合成的一种新型的苯并噻唑衍生物，已有实验证实，其可以通过线粒体途径诱导癌细胞凋亡，对多种癌细胞都有效果。本研究选定两种结直肠癌细胞进行一系列药理实验，结果证明YLT-322能够促进结直肠癌细胞凋亡，具有很好的开发前景。

1 材料

1.1 仪器

纯水仪（ EASYpure UF 07412,Millipore公司）；高效液相色谱仪（HPLC） （Waters Alliance HPLC,Waters公司）；全自动洗片机 （MXP 102, Kodak公司）；层流超净工作站（ NUAIR，SANYO公司）；二氧化碳细胞培养箱 （3111，Thermo公司）；荧光倒置显微镜 （IX50,Olympus

公司）；普通光学显微镜 （CHS, Olympus公司）；高速离心机（ Centrifuge 5415C, Eppendorf公司）；低速离心机 （Megafuge 1.0, Heraeus公司）；-80℃冰箱 （SANYO公司）；恒温培养箱（ CO2Incubator, SANYO公司）；高压灭菌锅（LaboAutoclave,SANYO公司）；pH计（ pH meter 345 Coring公司）；流式细胞仪（ ESP Elite, Beckman Coulter公司）；蛋白质电泳及电转移装置（ Mini PROTEAN 2&3 Cell, BIO-RAD公司）；台式酶标仪（ SpectraMax M5, Molecular Devices公司）；96孔细胞培养板（ Costa，Corning公司）；移液器（Thermo公司）。

1.2 药品及主要试剂

YLT322（本实验室自主合成），YLT-322是由本实验室（生物治疗国家重点实验室）自主合成的一种苯并噻唑衍生物，其结构式见图1。

图1 YLT-322结构式

RPMI-1640 （美国Gibico BRL公司）；DMEM（美国Gibico BRL公司）；四甲基偶氮唑蓝(MTT)（美国Sigma公司）；二甲基亚砜(DMSO) （美国Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Gibico BRL公司）；Hoechst33342（碧云天公司）；胎牛血清（FBS） （美国Gibico BRL公司）；结晶紫染料（国Sigma公司）。

1.3 细胞株

1.3.1 人结直肠癌细胞株SW620：来自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection, ATCC, Accession No.CCL-247），本实验室保存。

1.3.2 人结直肠癌细胞株SW480：来自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection, ATCC, Accession No.CCL-247），本实验室保存。

2 方法与结果

2.1 MTT法细胞毒性实验

SW620,SW48两种细胞铺96孔板，10000/孔，5000/孔，3000/孔各一板。用YLT322(已用二甲基亚砜(DMSO)配成10 mmol．L-1的初始浓度)处理，DMEM培养基对半稀释，最后配成浓度分别为10、 5、2.5、1.25、0.625、0.3125 µmol．L-1，作用时间为24 h，48 h，72 h，留1组不加药作为对照。加入10 μL MTT（5 mg．mL-1），37度孵育2 h，加入150 µLDMSO约15分钟，待甲瓒全部溶解，酶标仪检测吸光度，计算抑制率。结果见图2和图3。

图2 SW620细胞毒性试验

图3 SW480细胞毒性试验

图2和图3可以看出，在加药后24 h和48 h，随着浓度的增加,YLT-322对细胞有明显的抑制增殖作用,但加药后72小时，随着YLT-322浓度和作用时间的增加，细胞的抑制率较低，由此可知YLT-322对SW620和SW480有浓度依赖性和时间依赖性，说明YLT-322对SW620和SW480有促进凋亡的作用，且在48h左右作用效果最好。另外，低浓度偶可会出现抑制率为负值的情况，原因可能是药物本身的特点，和作用时间有关，或者是边缘效应。

2.2 平板克隆形成

SW620, SW480细胞铺6孔板，每孔300个，第2天用YLT-322处理，浓度依次为4、2、1、0.5、0.25 µmol．L-1，留1孔不加药作为对照。处理时间为14天左右，中间4天更换一次培养基。用PBS洗两次，多聚甲醛固定十分钟，结晶紫染色。结果见图4和图5。

图4 SW480平板克隆形成实验

图5 SW620平板克隆形成实验

从图4和图5可看出，随着YLT-322浓度的降低，细胞克隆数量越来越多，说明药物对细胞有良好的抑制增殖的作用。

2.3 Hoechst

SW620, SW480细胞6孔板做细胞爬片，每孔1.0×105个，第二天用YLT-322处理，浓度依次为4、 2 、1 µmol．L-1（细胞毒性实验中， 0.5和0.25 µmol．L-1对细胞抑制率极低，没必要再做实验）,留1孔不加药作为对照。处理48小时，hoechst 33342染色，取出爬片 ，荧光倒置显微镜观察。结果见图6和图7。

图6 SW620Hoechst观察

图7 SW480Hoechst观察

Hoechst是一种DNA染料，可使细胞核着色，是测凋亡的经典方法。正常细胞的细胞核染色均匀，荧光强度低，凋亡细胞的细胞核固缩、碎裂，细胞膜内陷，荧光强度较高。图6和图7可看出高浓度的组细胞核有碎裂，亮度较高，出现凋亡小体，证明YLT-322可促进此两种癌细胞凋亡。

3 讨论

YLT-322是本实验室自主合成的抗癌新药，已有前期实验证明其对肝癌有很好的活性，并且已申请专利。本实验进一步证明此化合物对结直肠癌细胞作用也很好，但由于时间所限，并未进行动物实验，相信在不久的将来，YLT-322将成为抗癌家族的重要一员，发挥其应有的作用，为癌症治疗带来新希望。

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（责任编辑：陈思敏）

Effect and mechanism of a novel Benzothiazole derivative YLT322 induce apoptosis in colorectal cancer cell

/YI Xiaohong1,2, SONG Xue-jiao1, HE Yu-ping1, GAO Tian-tao1, LEI Qian1, YU Luo-ting1// (1. State Key Laboratory of Biological Treatment of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan; 2. Basic Medical College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:YLT-322 was a new benzothiazole derivatives synthesized in our laboratory. There were literature reported that it could induce apoptosis in HepG2 via mitochondrial pathway. And it had effects on a variety of cancer cells. This experiment meant to investigate the effect of YLT-322 on colorectal cancer cells by a series of biological experiments.Method:Many kinds of cancer cells were screened. Two colorectal cancer cells were selected to carry out toxicity test, plate clone formation, Hoechst experiment to confirm that YLT322 had good inhibition effect on colorectal cancer.Result:Experimental group treated with YLT-322 signifcantly increased apoptotic cells compared with control group. And the effect of YLT-322 was proportional to the dose and duration time which confrmed the inhibition of YLT-322 on colorectal cancer.Conclusion:YLT-322 induce apoptosis in colorectal cancer cells. It has great value of development as a novel small molecule anti cancer drug.

Benzothiazole derivative YLT322; colorectal cancer; apoptosis; cell toxicity test; plate clone formation; Hoechst

R 73-3

A

1674-926X(2015)02-020-03

1.四川大学生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041;2.成都中医药大学基础医学院，四川成都 611137

易晓红，女，32岁，成都中医药大学讲师，在读硕士研究生

Tel:13540667372 Email:13540667372@163.com

余洛汀，男，四川大学生物治疗国家重点实验室，博士生导师 Email:luodyu@163.com

2015-01-26