改良溴化乙锭染色法快速检测基因组DNA

田秀荣，郭丽，高兵，刘健

（沈阳医学院1.细胞生物学与遗传学教研室；2.科学实验中心，沈阳 110034）

改良溴化乙锭染色法快速检测基因组DNA

田秀荣1，郭丽2，高兵1，刘健1

（沈阳医学院1.细胞生物学与遗传学教研室；2.科学实验中心，沈阳 110034）

目的探讨一种耗时少、检出率高的基因组DNA检测方法。方法采用改良的溴化乙锭染色法检测提取到的样本基因组DNA。采用分光光度仪进行敏感性验证，聚合酶链式反应确认该方法能否用来检测PCR产物。结果改良的溴化乙锭染色法显著减少基因组DNA的上样量，提高基因组DNA的检测敏感性，节省操作时间，无需loading buffer，并可粗略估计基因组DNA浓度。结论改良的溴化乙锭染色法只适用于初筛样本基因组DNA，不能用于评估DNA片段的长度。

琼脂糖凝胶电泳法；基因组DNA；溴化乙锭

基因组DNA提取被广泛应用于医学、生命科学的许多领域［1］。2003年人类基因组计划的完成，为人类利用基因组DNA遗传密码破解疾病机制奠定了基础［2］。成百上千例样本的病例-对照研究越来越多的被用于筛选疾病相关候选基因及其变异位点和在基因水平阐明疾病的发病机制。这些研究中需要先期进行大规模的样本基因组DNA提取和检测工作。

长期以来，基因组DNA提取后的检测是通过琼脂糖凝胶电泳/溴化乙锭染色法进行观察［3～5］。这种方法在基因组DNA样本检测的时候，需要样本DNA的上样量较大。在微量DNA上样时或提取的基因组DNA含量低时，敏感性差，不易观察到阳性结果。此外，琼脂糖凝胶电泳检测法用于检测大批量样本基因组DNA时，显得有些费时、费材、费力。

考虑到琼脂糖凝胶电泳/溴化乙锭染色的这些缺点，本研究介绍了一种改良的溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色法（以下简称“改良法”），该方法可以快速初筛样本基因组DNA。

1 材料与方法

1.1 样本及基因组DNA提取

本研究经沈阳医学院学术委员会同意，遵守知情同意原则，从沈阳市第四人民医院门诊采集161例正常人末梢静脉血液样本。血液经EDTA抗凝后，保存于-20℃冰箱。采用Blood Genome DNA Extraction试剂盒（D9081，TaKaRa公司）提取样本的全血基因组DNA，所有操作按照试剂盒提供的操作流程进行。取100 μL全血，加入GenTLE Solution 1破坏血细胞，同时与核酸形成电中性的复合体，Gen-TLE Solution 2清洗，GenTLE Solution 3分离基因组DNA，用异丙醇回收DNA沉淀。

1.2 改良的溴化乙锭染色检测基因组DNA

剪切适当大小的PARAFILM®“M”封口膜，按照检测样本数在封口膜上间隔适当间距均匀点样2 μL 0.5 μg/mL EB，分别吸取2 μL待检DNA样本与封口膜上EB充分混合，室温下静置2～3 min，将封口膜置于暗箱式双光紫外仪下观察实验结果。DNA与EB混合呈棕黄色斑点，无DNA的斑点呈无色透明。

1.3 敏感性验证

提取的样本基因组DNA用分光光度仪进行浓度检测，用CDNA表示DNA浓度，DNA纯度Ratio值为A260/A280比值。取5 μL样本基因组DNA依次进行2×、4×、8×、16×和32×的倍比稀释。用改良法和传统的凝胶电泳检测法依次进行检测，改良法基因组点样量为2 μL，凝胶电泳法每孔上样量为5 μL。琼脂糖凝胶电泳法实验步骤概括如下，配制1%琼脂糖凝胶块（含0.5 μg/mL EB），将5 μL基因组DNA与1 μL 6×loading buffer充分混合后上样。100 V电泳30 min，暗箱式双光紫外仪下观察实验结果。

1.4 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

为确认改良的EB染色法能否用来检测PCR产物，随机选取10例DNA样本进行PCR扩增反应。应用TaKaRa Taq酶（DR001A，TaKaRa公司），扩增β -actin基因片段，正向引物为5′-TCGTGCGTGACATT AAGGAG-3′；反向引物为5′-AGCACTGTGTTGGC GTACAG-3′，产物为369 bp。反应条件：96℃，1 min；30个循环的94℃30 s，60℃30 s和72℃60 s；72℃2 min。反应体系为25 μL。PCR反应产物分别与单独加入的dNTP组、DNA模板组、引物组进行比较。

1.5 统计学方法

应用SPSS 10.0统计软件包，琼脂糖凝胶电泳/ EB染色法和改良EB染色法的DNA检出率的比较采用配对χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 改良EB染色法检测基因组DNA

经分光光度仪检测待测DNA的A260为0.19，CDNA为7.06 ng/μL，Ratio为1.865。在紫外仪下EB与基因组DNA按1∶1混合后与单一DNA组、EB组及灭菌蒸馏水组比较，其荧光强度明显增强，肉眼即可清晰分辨，见图1。

图1 改良法检测基因组DNAFig.1 An improved method to detect genomic DNA

2.2 检测敏感性比较

通过倍比稀释，比较2种基因组检测方法的检测敏感度。结果显示，凝胶电泳法在基因组DNA在经8倍稀释后就几乎看不到荧光，而改良法在基因组原液稀释16倍后仍可观察到较明显的荧光，见图2。

图2 改良法和电泳法检测稀释的基因组DNA结果Fig.2 Comparison of the results from the improved method and electrophoresis method for the dilution of genome DNA detection

2.3 改良EB染色法和凝胶电泳法检测样本基因组DNA

进一步通过2种检测法检测161例新提出样本的基因组DNA，改良法共检出106个样本，传统的琼脂糖凝胶电泳法检出65个样本（表1，图3）。结果表明改良法的样本检出率明显高于凝胶电泳法（P＜0.001），说明2种方法在检出敏感性上具有显著的差异。

用传统的琼脂糖凝胶电泳法检测基因组，一般的制胶板制作的胶要少于20孔，1次电泳检测的样本数要低于20个，而改良法1次可检测50个样本。分别用这2种方法检测同一基因组DNA。结果显示：改良法与传统凝胶电泳法检测DNA，2种方法的差异有统计学意义，见图3。

2.3 操作时间比较

凝胶电泳法检测分为配胶、制胶、上样、电泳、观察几个步骤，配胶制胶用时需1 h，上样时间与样本数有关，每个样本的平均上样时间约1 min，电泳30 min，总用时约90 min。改良法直接将基因组DNA与EB混合，无需将基因组DNA与loading buffer混合，仅需要点样时间即可。因此要检测同样数量的样本，改良法比凝胶电泳法要少用时90 min。

表1 改良法和电泳法检测161例样本基因组DNA结果Tab.1 Detection of 161 cases of genomic DNA samples using improved method and electrophoretic method

图3 改良法和电泳法检测基因组DNA检测结果对照Fig.3 Comparison of genome DNA detection by improved method and electrophoretic method

2.4 PCR产物检测

10例DNA样本的β-actin基因片段被扩增，用“改良法”进行检测，与单独加入dNTP组、DNA模板组、引物组进行比较发现，斑点均呈现棕黄色。

3 讨论

研究疾病的发生与致病基因及其相关变异并在此基础上阐明疾病的机制一直是研究人员努力的方向。目前，包括癌症、心血管疾病、精神疾病、高血压和糖尿病在内的各种复杂疾病的基因组学研究都全面展开［6～8］。在这些研究中均需要进行大样本基因组DNA的基础提取和检测工作。本研究首次介绍了一种高敏感度的快速检测基因组DNA的方法。该方法在DNA的上样量、敏感性、检测时间和使用材料上都具有显著的优点。

基因组DNA的提取受样本条件、提取方法和操作技术的影响，经常会出现提取失败或只提取了少量DNA的情况，因此需要对提取后的DNA进行检测，以确保下一步实验的顺利进行。目前广泛使用的是传统的琼脂糖凝胶电泳法和分光光度仪法。琼脂糖凝胶电泳法在检测大批量样本时，因需要制胶、上样及电泳过程而耗费一定的人力和时间。DNA上样量较大，存在DNA浪费情况，不适用于稀少样本的DNA检测。为避免电泳过程中DNA损失，DNA样品上样时需与loading buffer进行混合。此外，电泳后DNA条带的敏感性差，微量DNA上样时更不易观察结果。分光光度仪法是检测DNA浓度的常用方法，但有时受到仪器性能的限制，待检测DNA样本的原始用量较大、操作繁琐、易出现误差。DNA量不足时，吸光度检测结果不可信。因此，尽管以上方法被广泛应用于研究领域，但还存在一定的弊端。

本研究提出的“改良EB染色法”在一定程度上解决了前述方法的一些弊端。首先，显著提高了DNA检测敏感度，较低浓度的DNA也可被检出，同时本方法也可根据斑点亮度来初步估计DNA量的多少。其次，因本方法敏感度高，可减少DNA样本的上样量，节省了样本，尤其在稀有DNA样本的处理中更具有意义。本研究中，改良法的基因组用量仅2 μL即可观察到斑点颜色改变。第三，操作简便省时，节省实验用品。20个样本琼脂糖凝胶电泳约需要2 h；而本方法仅需要2～3 min即可，节省操作时间。另外，在实验的用材方面改良法只需少量的封口膜和0.5 μg/mL EB一种溶液，从而大幅度简化了检测程序，降低了实验成本。

本方法在使用中也具有一定的局限性。因其不能评估DNA片段长度，因此更适用于基因组DNA提取后的初步筛检和对基因组DNA浓度的粗略估测，不适合用于验证PCR结果。本方法可与琼脂糖凝胶电泳法和分光光度仪法协同使用，在精确检测的基础上，将更加快速、简便。

［1］Wellcome Trust Case Control Consortium，Craddock N，Hurles ME，et al.Genome-wide association study of CNVs in 16，000 cases of eight common diseases and 3，000 shared controls［J］.Nature，2010，464（7289）：713-720.

［2］Vonholdt BM，Pollinger JP，Lohmueller KE，et al.Genome-wide SNP and haplotype analyses reveal a rich history underlying dog domestication［J］.Nature，2010，464（7290）：898-902.

［3］朱英，陶刚，刘作易，等.琼脂糖凝胶电泳操作中值得注意的几个问题［J］.贵州农业科学，2004，32（6）：27-28.

［4］黄永莲.琼脂糖凝胶电泳实验技术研究［J］.湛江师范学院学报，2009，30（6）：83-85.

［5］孙岩，李武修，唐胜建.琼脂糖凝胶厚度对DNA电泳的影响［J］.潍坊医学院学报，2005，27（2）：103-107.

［6］Pierce BL，Ahsan H.Genome-wide"pleiotropy scan"identifies HNF1A region as a novel pancreatic cancer susceptibility locus［J］. Cancer Res，2011，71（13）：4352-4358.

［7］Rasmussen-Torvik LJ，Li M，Kao WH，et al.Association of a fasting glucose genetic risk score with subclinical atherosclerosis：The Atherosclerosis Risk in Communities（ARIC）study［J］.Diabetes，2011，60（1）：331-335.

［8］Brockschmidt A，Filippi A，Charbel Issa P，et al.Neurologic and ocular phenotype in Pitt-Hopkins syndrome and a zebrafish model［J］. Hum Genet，2011，130（5）：645-655.

（编辑 于 溪）

An Improved Ethidium Bromide Staining Method for Rapid Detection ofGenomic DNA

TIAN Xiu-rong1，GUOLi2，GAOBing1，LIUJian1

（1.Cell Biology and Genetics Department of Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Science Experiment Center of Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

Objective To explore a genome DNA detection method with less time-consuming and high detection rate.MethodsGenomic DNA samples were extracted and detected with improved ethidium bromide staining method.The sensitivity was verified with spectrophotometer meter. Polymerase chain reaction was used to confirm whether the method was available for detecting the PCR product.ResultsThe improved ethidium bromide staining method significantly reduced the quantity of genomic DNA sample applied to gel，improved the detection sensitivity of genomic DNA and saved operating time with no need for loading buffer.In addition，it can roughly estimate the concentration of genomic DNA.ConclusionThe improved ethidium bromide staining method can be applied to screening genomic DNA sample，but it cannot assess the length of DNA fragments.

agarose gel electrophoresis；genomic DNA；ethidium bromide

O657

B

0258-4646（2015）11-0999-03

田秀荣（1963-），女，高级实验师，大专. E-mail：tianxiurong2008@163.com

2015-01-26

网络出版时间：