反向代谢工程研究进展

周筱飞，陈婷婷，田　野，黄　敏，施碧红,2

(1.福建师范大学生命科学学院，福建　福州　350108；2.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建　福州　350108)



反向代谢工程研究进展

周筱飞1，陈婷婷1，田野1，黄敏1，施碧红1,2

(1.福建师范大学生命科学学院，福建福州350108；2.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建福州350108)

摘要：反向代谢工程通过构建具有遗传多样性的突变文库，结合有效的高通量筛选技术，从而获得由多基因控制的复杂表型。目前，它已成为工业生物技术中研究生物代谢途径和改造菌株性能的强有力工具。反向代谢工程研究中的一个瓶颈问题是如何获得多样化的细胞表型突变库，该文介绍了几种经典的和近期发展起来的解决该瓶颈问题的方法，并列举了这些方法的最新应用进展。

关键词：反向代谢工程；突变库；细胞表型；高通量筛选

生物的代谢途径是一个复杂的网络结构，细胞的表型与基因型之间并非是线性对应关系，往往多个基因共同控制着细胞的某一特定表型[1]。传统的代谢工程育种方法以代谢分析和代谢改造为主，主要依赖于对单个或多个特定基因进行敲除或过量表达。在具体的实践中常采用削弱已有的代谢途径、扩展已有的代谢途径及构建新的代谢途径等方法，但是这些方法很大程度上仅仅是应用分子生物学的某种表现形式，且采用这些方法对菌株进行成功改造的一个先决条件是对某一代谢产物或特定表型产生的生化途径有清晰的认识。鉴于细胞代谢系统的复杂性，以及目前人们对细胞代谢网络认识的局限，利用传统方法的育种结果往往并不理想[2]。20世纪80年代以来，包括基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等组学技术的快速发展极大的促进着代谢工程的发展和应用，使人们开始在系统水平上更加全面的评估细胞表型，并催生了一种新的代谢设计策略——反向代谢工程(Inverse metabolic engineering，IM，也称逆代谢工程)[3-4]。这是一种利用基因组学理论，采用逆向思维方式进行代谢设计的新型代谢工程，整体思路是，先在异源生物或相关模型系统中，通过计算或推理确定所希望的表型，然后确定决定该表型的基因或特定的环境因子，最后通过基因改造或环境改造使该表型在特定的生物中表达[5]。

反向代谢工程可以使人们快速的实现“表型—基因型—表型”一体化的基因重组策略，是现代工业生物技术中进行代谢途径研究及菌株改造的强有力工具。反向代谢工程研究中的一个主要瓶颈问题是如何获得目的表型的突变库，在其发展的几十年间，研究者已经开发了实施该策略的多种方法，本文介绍了其中的几种主要方法及其原理，总结并评述了这些方法的应用及进展。

1传统反向代谢工程技术

传统的反向代谢工程技术包括自发突变、物理化学诱变及转座突变等[6]。自发突变的现象早在上千年前就被人类加以利用，近年来已有不少利用自发突变介导的反向代谢工程方法所取得的成功报道，如获得高产1,3-丙二醇的肺炎克雷伯菌株[7]、增强酿酒酵母对木聚糖的利用[8]等。

物理化学诱变是一种经典的选育优良菌株的方法，该技术通过选择合理的诱变剂，主要对代谢产物合成的某些关键基因进行突变，结合有效地筛选策略，获得性状优良的目标菌株，但突变的基因并不清楚。物理化学诱变操作简单，技术要求低，在特定的历史时期为工业微生物的发展做出了巨大的贡献，目前我国的工业微生物生产中，仍不少生产菌株是通过诱变育种获得。周希贵等[9]用亚硝基胍(NTG)对多粘类芽孢杆菌进行诱变处理，筛选到一株粘杆菌素高产突变株。

转座现象由McClintock在对玉米色斑稳定性研究中首次发现，该发现打破了基因在染色体上线性静态排列的传统理论[10]。转座子是存在于染色体上可以自主复制和移位的基本元件，是介导转座现象产生的根本原因。利用转座系统，可以产生包括基因的插入、缺失、颠倒及融合等各种突变。随机转座突变技术是最常用的一种分离与克隆基因的转座策略，利用转座子可以向整个基因组的任意位点随机的插入一段基因，使基因突变失活，随后引起一定的表型变化，在不需要鉴定待测目的基因产物的情况下，即可分离鉴定基因[11]。Ozydin B等[12]利用转座突变技术向单倍酵母缺失细胞中插入编码类胡萝卜合成酶的基因，鉴定出了引起类异戊二烯产量提高的基因缺失，Clancy等[13]也利用该技术成功的确定了链球菌编码输出蛋白的基因。

2新兴发展的反向代谢工程技术

传统的反向代谢工程技术在工业生产中已经取得了很大的成效，但是鉴于这些方法研究周期长、工作量大且操作存在安全隐患等诸多方面的原因，人们正着力寻找并开发其他有效解决上述问题的新型手段。在转录水平上使细胞的基因组发生全局性的改变，可以有效地获得由多个基因共同控制的复杂目的表型。以下介绍了其中的几种方法，重点概述了近年来兴起的全局转录机器工程。

2.1　全局转录机器工程

2006年，美国麻省理工大学的Alper等[14]提出了一种对细胞整体的转录进行全局性改变的新技术，即全局转录机器工程(Global transcription machinery engineering，gTME)。gTME通过对转录复合体中的关键转录元件进行定向进化，结合高通量筛选技术，最终获得目标性能得到全局强化的优良菌株。理论上，gTME中用作改造对象的转录元件有很多，下面简要介绍基于其中几种重要元件的全局转录机器工程原理及其应用。

2.1.1基于RNA聚合酶的全局转录机器工程在全局转录机器工程研究中，RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)是最初的被选作突变的改造对象。众所周知，基因的转录是在RNAP的作用下，以DNA为模板合成mRNA的过程。RNAP是转录元件中的关键元件，对RNAP的突变可能在全局范围内引起众多受控基因转录水平的波动，从而发生基因组的全局转录重排，筛选出感兴趣的细胞表型。

原核生物的RNAP是一个由多种蛋白亚基组成的复合酶，有核心酶(α2ββ′ω)与全酶(α2ββ′ωσ)两种形式。核心酶只在RNA链的延长阶段发挥作用，只有在加入σ亚基形成全酶后，DNA的转录才会起始。σ亚基能够特异性地识别并结合在启动子的-35和-10区，从而激活基因转录起始过程[15]。各种微生物的首要σ因子的氨基酸序列均有较保守的区域，序列有着相似性。大肠杆菌的首要σ因子σ70控制着约1000个基因的转录表达，σ70的突变能改变RNAP对启动子的偏好性[16]。Alper等[14]对编码σ70的rpoD基因进行易错PCR，建立了一个近106的rpoD基因突变库，经过高通量筛选，同时快速选育到多个不同优良性状的突变株，包括乙醇耐受突变株(60 g/L)、SDS耐受突变株、乙醇/SDS双耐受突变株和高产番茄红素突变株(7000 g/L)。采用代谢控制育种手段，支链氨基酸的产量已经达到某种“饱和”现象，为此，对编码黄色短杆菌首要σ因子的sigA基因进行随机突变，初步筛选到多株L-Ile产量提高的突变株，这将对氨基酸生产育种具有重要意义。此外，gTME也被成功应用到真核生物代谢工程中。对酿酒酵母的RNA聚合酶Ⅱ转录因子的TAF25亚基(SPT15)和辅助因子(TAF25)进行定向改造，获得了一株在6%乙醇条件下生长速率高于对照组13倍的突变株spt15-300[17]。

这是将gTME成功应用到反向代谢工程中的典范，在此之后研究者也对其它的RNAP元件进行了改造，相继报道过许多成功案例。α亚基与RNAP四聚体的核心(α2ββ′)的形成有关，也可能参与到对相应启动子的识别与结合中[18]。Klein等[19]通过对大肠杆菌rpoA进行随机突变，构建了α亚基的随机突变库，筛选的结果表明，α亚基的突变同样能够促进透明质酸和L-络氨酸的合成，也能够提高菌株对丁醇的耐受性。

2.1.2基于CRP的全局转录机器工程环磷酸腺苷受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP)是一个相对分子质量为42 kDa的同源二聚体蛋白，在原核生物的转录调控中发挥重要作用。细胞中以游离形式存在的CRP是没有调控功能的，当与胞内受体分子cAMP结合后，其自身构象发生一系列变化，从而使其功能得到激活[20]。研究表明，CRP-cAMP复合物调控约400个基因的转录表达，它与启动子的结合是这些基因转录起始的必要条件[21]。CRP的全局转录效应已被应用到生产实践中，并取得了很大的成效。

耐渗性是一个由多种基因共同控制的表型，Zhang等[22]利用易错PCR构建了crp基因的随机突变文库，并连接到低拷贝载体转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到5株对NaCl耐性提高的突变株，随后以这五个突变株为模板进行DNA改组，最终获得的突变株在0.9 mol/L NaCl条件下比生长速率为0.113 h-1，大大高于野生菌株。工业发酵中菌株对异丁醇的敏感性大大限制了异丁醇的大量生产，研究表明，全局转录因子CRP参与到大肠杆菌对异丁醇的应答反应中，据此Chong等[23]通过构建CRP的随机突变文库，选育到了能够在1.2%异丁醇条件下生长良好的突变株，且突变株的选育周期已由经定向进化的180天缩短至3~5天，这再次证明了全局转录在工程育种上的独特优势。

2.1.3基于外源转录因子的全局转录机器工程通常情况下，全局转录策略实施的背景是针对同种亲缘菌株，即选择某一菌株自身的全局转录因子作为突变对象，最终突变因子的受体仍然是该原始菌株，或是将该菌株改造(物理诱变、化学诱变等)后的突变株。在全局转录机器工程发展的近十年中，人们也对此方法及其理论做了进一步的拓展与完善。当前人们已成功的实现了gTME在不同种间的应用，这对某些生物种群所特有的优势基因，如极端微生物耐受基因的开发与利用具有重大意义。

众所周知，极端微生物是能适应某些极端环境(如高温、低温、高酸、高碱、高盐、高压、高辐射等)的特殊种类，因此极端微生物的基因组可以作为某些耐受性状的基因池[24]。在工业生产中，常常是由于菌株对某些条件(渗透压、有机溶剂等)的敏感性导致生产的低效率，如果将极端微生物的耐受基因在生产菌中成功表达，很可能使某些生产菌株的耐受性能大大提高，从而提高生产效率。研究表明，irrE是控制耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)的耐高辐射性状的一个关键转录因子，它的表达与recA、pprA等的表达，以及过氧化氢酶的活力紧密相关[25-26]。Pan J等[27]克隆了耐辐射球菌的irrE，并让其在大肠杆菌细胞中表达，发现大肠杆菌的耐渗性能有了一定提高。将野生菌与工程菌进行蛋白质组学分析对比，发现在导入irrE后大肠杆菌细胞中共有124个蛋白的表达发生了改变，这样大规模的改变可与利用gTME改造菌株后的蛋白改变数量相当，这一点引起了研究者极大的兴趣。由于在导入irrE后，除了耐渗性以外，并未发现转化子其他相关表型的改善，如耐乙醇、耐酸等。考虑到irrE的转录调控作用及转化子的蛋白质改变水平，Chen T等[28]在上述研究的基础上，构建irrE随机突变库，先后在5%乙醇、0.625%丁醇、0.05%醋酸盐的背景下筛选突变株，分离得到了多株性状优良的突变株。与包含野生irrE基因的菌株相比，相关突变株的乙醇耐受性、丁醇耐受性、醋酸盐耐受性分别有了显著提高。Chen T等的研究表明，耐辐射球菌与大肠杆菌的转录调控系统有一定的相似性，外源性的转录因子也能够在新的宿主细胞中发挥转录调控功能。这是人们首次将经人工改造后的外源性全局调控因子成功应用到异缘宿主细胞，是对现有的提高菌株耐受性工业育种手段的补充，更是对全局转录机器工程的完善。此外，可用作改造对象的转录元件还有很多，如H-NS[29]、Hha[30]、β亚基[31]等，这里不作一一赘述了。

全局转录机器工程对各种革兰氏阳性菌与阴性菌、酵母菌等真核微生物等均具有普适性，是反向代谢工程的一种重要新技术。它为工业微生物育种中对菌株进行改造提供了全新的思路与方法，也使得快速高效地获得具有遗传稳定性的全局最优表型成为了可能。

2.2　多基因启动子改组

启动子是RNAP的识别与特异性结合位点，对启动子的序列进行突变修饰，可以改变由这类启动子调控的基因的表达。对启动子的改变可以从强度与调节功能两方面着手。研究表明，对某些关键酶基因进行过表达或敲除，要么会造成细胞内部负担过重，引起胞内整体代谢不平衡，要么会影响到其他分支代谢通路的前体物供应，而适度表达则对代谢产物的积累是最有利的。此外，往往多个基因共同控制着代谢途径中的关键限速步骤，使这些基因的表达达到平衡的状态才能成功地实现反向代谢工程操作。2007年，Lu C等[32]首次提出多基因启动子改组(Multiple gene-promoter shuffling，MGPS)方法。MGPS实施的基本思路是：选择关键基因不同活性范围的启动子，将这些启动子与多个控制某一代谢途径的关键基因进行随机组合，并转化受体菌，最后筛选出具有优良性状的转化子。PYK1、TKL1、TAL1是酵母菌糖酵解途径与木糖代谢途径中的3个关键酶基因，将它们与强启动子HXK2和弱启动子GND2进行不同的组合，转化酵母，从组合文库中筛选到了高效利用木糖的乙醇高产菌株[32]。上述HXK2、GND2均是野生型的启动子，如若结合启动子的定向进化，对这些启动子进行突变，将很有可能得到性状更优的突变株。

2.3　人工转录因子工程

转录因子是一类对基因表达调控起重要作用的反式作用因子，通常由两部分组成：DNA结合结构域(DNA binding domain，DBD)与效应结构域(Effector domain，ED)，前者能够特异地识别并且结合其对应的DNA序列，使该转录因子能够定位到靶基因；后者通常是一个激活因子或者抑制因子，能够激活或者抑制靶基因的表达。DNA结合结构域与效应结构域在表达调控中独立地发挥各自的作用，人为地将不同的结构域与效应域进行组合，或是通过计算机人为设计模拟天然转录因子的两种区域，即可获得自然界中不存在的、具有新的序列特异性与作用效果的人工转录因子(Artificial Transcription Factor，ATF)[33]。

成功构建人工转录因子的核心工作是构建特异性地DNA结合结构域，锌指结构(Zinc finger proteins，ZFPs)是真核生物中最常见的DNA结合模体，每个锌指能识别三个碱基的DNA序列，细胞内的很多调节蛋白都含有一个或者多个锌指结构[34]。相比于其他的DNA结合结构域，锌指结构可以识别非回文序列，并且不受其识别序列的长度和结构的限制，仅仅对几个关键位点的氨基酸加以改变就可以使锌指结构的识别特性发生变化，因此锌指结构成为转录因子模块化设计中首选的DNA结合结构域[35]。Park等[36]对酵母的多个锌指结构进行随机重排，构建了人工锌指基元文库，成功筛选到耐热性、耐渗性及耐药性显著提高的突变株。将来自酵母的锌指蛋白文库中三指和(或)四指的编码基因进行突变，并使其在大肠杆菌中表达，在50℃条件下培养2 h，获得了23个耐热性大大提高的突变株。

在设计人工转录因子时，通过改变DNA结合结构域可以灵活选择其作用靶位点，为了赋予人工转录因子对基因表达更好的激活、抑制或甲基化等调控功能，通常在设计的同时也要加上不同的效应结构域，包括激活结构域和抑制结构域。效应结构域的应用十分灵活方便，常用的激活结构域有单纯疱疹病毒(Herps Simplex Virus)的VP1和来自NF-кB的p65亚基。Beerli等[37]利用六锌指蛋白与4个VP16激活域构建的新的人工转录因子激活乳癌细胞系中原癌基因erbB-2与erbB-3的表达。常用的抑制结构域有转录因子SID(Sin3a interaction domain)结构域和KOX1 的KRAB(Kruppe1-associated box)结构域。Bartsevich等[38]将两个KRAB-A的抑制域与五个锌指结构域进行组合，构建的人工转录因子能很好地抑制K562细胞中多耐药基因(MDR1)的表达。

人工转录因子已成为人工干预内源性基因表达的有力工具，经济高效、应用灵活，在药物设计、基因治疗等研究领域起着重要作用。当前研究者正致力于构建更加精细的特异人工转录因子，只有在细胞受到刺激，相应的信号转导通路启动后，人工转录因子才被激活，进而发挥相应作用。随着技术的进一步发展，人工转录因子的在各个领域定会得到更广泛的应用。

2.4　核糖体工程

核糖体工程(Ribosome engineering)是由日本科学家Kozo Ochi率先提出的一种推理育种新方法，运用核糖体工程育种手段可以对微生物进行改造并向其引入复杂表型[39]。

作为蛋白质的合成机器，核糖体结构(包括核糖体蛋白和rRNA)和功能的改变，直接影响蛋白质的合成能力，在微生物的次级代谢产物的调控方面发挥着关键性的作用。四磷酸鸟苷酸(ppGpp)是诱导微生物“严谨反应”的信号分子，在微生物次级代谢产物的合成中起着重要的作用，当微生物的生长进入到稳定期时，由于营养物质的匮乏，细胞中核糖体的氨酰-tRNA的结合部位会与游离的tRNA结合，从而终止蛋白合成。此时细胞会通过自身的应激通路，将蛋白合成终止的信息传递到ppGpp的合成基因relA，ppGpp开始合成，进而激活各种次级代谢产物的生物合成。很多抗生素主要是通过与核糖体的某些部分相结合来抑制蛋白质的合成，进而起到类似于严谨反应同样的作用效果[40]。因此通常微生物对抗生素抗性的变化是某些核糖体突变的直接反映，利用各类抗性突变为筛选标记，可以获得核糖体功能突变的菌株，从而间接筛选到有利于次生代谢产物积累的突变株。常用于抗性筛选的抗生素主要包括链霉素(Str)、庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)、硫链丝菌素(Tsp)、巴龙霉素(Par)、林肯霉素(Lin)和遗传霉素(Gnt)等。

核糖体工程操作简单易行，在提高次级代谢产物产量及激发潜在沉默基因表达方面最具理论基础，其在选育抗生素高产菌株方面的应用最多。例如，核糖体蛋白SI2赋予了链霉菌对链霉素的抗性，Ochi等[41]对编码核糖体SI2蛋白的rpsL进行突变，获得了能够大量积累放线紫红素的突变株。16S RNA甲基转移酶由rsmG基因编码，Nishimura等[42]向rsmG引入突变，获得大量抗链霉素的天蓝色链霉球菌突变株。研究还发现，抗性选育的高产性状具有叠加性。Nishimura等[42]利用rpsL和rsmG的组合突变，得到突变株的抗生素产量显著提高。

3总结及展望

传统的反向代谢工程技术因为其育种周期长、工作量大、步骤繁琐且操作存在一定的安全隐患，其应用受到了很大的限制。而近年来，新兴发展的全局转录机器工程、人工转录因子工程、核糖体工程等以它们自身的独特优势而逐渐受到研究者的青睐。除了上述这些正快速发展或发展成熟的方法外，最近发展起来的基因组多重自动修复技术(Multiplex automated genome engineering，MAGE)及多重染色体重组技术(Trackable multiplex recombineering，TRMR)的研发也可以为获得理想的突变文库提供可借鉴的方法。在实际的育种过程中，上述方法并不是单独应用的，同时结合多种方法往往能够取得更优的结果。

系统生物学是在组学技术的基础上发展起来的代谢工程研究方法。利用组学技术，我们可以在系统水平上对反向代谢工程中获得的正向突变菌株进行代谢通量分析和转录组学分析，更加精确地评估细胞表型。随后根据分析结果，利用现代生物信息学技术，对细胞进行进一步的设计、修饰和合理改造，使人们快速的获得更优良的微生物生产菌株。

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2014年福建省新批办台资农业项目35个

2014年1-12月福建省新批办台资农业项目35个，合同利用台资1.1亿美元。

据介绍，福建省累计批办台资农业项目2509个，合同利用台资34.8亿美元，实际到资19.6亿美元，农业利用台资的数量和规模继续位居大陆第一。

2014年闽台农产品贸易突破15亿美元，同比增长18%以上，呈持续增长态势。其中，厦门口岸继续保持进口台湾水果的第一大进境口岸，成为台湾水果销往大陆各地的重要中转站。

此外，福建省10个闽台农业合作推广示范县2014年引进台湾果树、食用菌、蔬菜、中药材等新品种45种，引进新技术28项，建立良种及技术示范基地4000多hm2，推广带动8万多hm2。

[摘自：福建农业信息网.(2015-02-03). http://www.fjagri.gov.cn/html/mthz/mtdt/2015/02/03/140262.html.]

Advances on Inverse Metabolic Engineering

ZHOU Xiao-fei1, CHEN Ting-ting1, TIAN Ye1, HUANG Min1, SHI Bi-hong1,2

(1.CollegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou,Fujian350108,China;

2.EngineeringRescherCenterofIndustrialMicrobiology,MinistryofEducation,FujianNormal

University,Fuzhou,Fujian350108,China)

Abstract:Inverse metabolic engineering is a kind of new genetic engineering, which can get complex phenotypes regulated by multiple genes by constructing a library of cells with genetic diversity, following with efficient high through-put screen. Currently, it has become a powerful tool for researching biological metabolic pathways and modifying the biological properties of strains in industrial biotechnology. One of the bottleneck problems in inverse metabolic engineering is how to obtain a variety of cell phenotype mutant library. This paper briefly introduced several classic and recently developed ways to solve the bottleneck problem, and listed the latest research progresses of these methods.

Key words:inverse metabolic engineering; mutant library; cell phenotype; high through-put screen

文献标志码：A

文章编号：1637-5617(2015)01-0073-06

中图分类号：Q78

doi:10.16006/j.cnki.twnt.2015.01.016

基金项目：福建省科技重点项目(2009N0033)

通讯作者：施碧红(1968-)，女，博士，教授，研究方向：微生物分子生物学. E-mail：shibh@fjnu.edu.cn

作者简介：周筱飞(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：微生物遗传育种. E-mail：773737480@qq.com

收稿日期：2014-12-13