Nrf2/ARE通路调节机制的研究进展

易小芳，谭超

Nrf2/ARE通路调节机制的研究进展

易小芳，谭超△

核因子E2相关因子Nrf2是一个参与多种蛋白表达的核转录因子，是机体氧化应激反应的调节中枢，它与抗氧化反应元件（ARE）结合后可启动下游多个抗氧化、抗炎蛋白及解毒酶等的表达，其介导的这一信号通路参与了炎症、肿瘤等多种病理过程的发生发展。本综述在阐述其基本结构、生物学效应以及介导的信号通路的基础上，针对各种参与该信号通路正负向调控的因素及调控机制的最新研究进展进行了概述，为抗炎症、抗氧化以及抗肿瘤等生物化学治疗提供了新的靶点，在此基础上，本文也展望了生物信息学技术的应用将会为这一靶点的干预提供更好的发展前景。

Nrf2；Nrf2/ARE信号通路；氧化性应激

核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor，Nrf2）属于Cap′-n′-Collar（CNC）家族的转录因子［1］。作为抗氧化转录因子，Nrf2与抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）结合，启动下游多个抗氧化、抗炎蛋白及解毒酶等的表达，构成Nrf2/ARE通路，是机体抵御各种氧化应激的重要保护通路。Nrf2在解毒器官如肝、肾以及与外界环境接触的器官，如皮肤、肺、消化道等有大量表达。作为抗氧化应激的调节中枢，Nrf2在机体内的表达及其调控具有重要意义，本文对新近研究进行综述。

1 Nrf2的基本结构

Nrf2含589个氨基酸，属于CNC家族的碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子［2］，含有6个区，即Neh1～6，其中Nehl区的亮氨酸拉链结构bZIP可与小Maf蛋白结合形成异源二聚体，进而获得与抗氧化元件ARE上DNA分子结合的能力，Neh2是Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）结合的区域，这一区域即Nrf2的第69～84氨基酸这一包含16个氨基酸的短肽，它包含了与Keap1结合的ETGE基序和DLG结合位点。Neh4和Neh5区则是和共激活因子环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）结合后辅助Nrf2靶基因转录激活［3］，这一过程与Nrf2的第596和599位氨基酸被CREB（CREBBP）乙酰化有关。Neh6区含有大量的丝氨酸残基，是氧化还原非敏感区，在氧化应激状态下与Nrf2的降解相关。另外，Nrf2的第40位氨基酸是磷酸化位点，Nrf2的磷酸化对其与Keap1解离及发挥生物学功能有关。

2 Nrf2的活性

2.1 Nrf2/Keap1复合体 在生理状态下，Keap1作为Nrf2的负调控因子将Nrf2锁定在胞浆内并介导其泛素化以维持胞内Nrf2的稳态［4］。Keap1由BTB、IVR、双甘氨酸重复区域（double glycine repeat or Kelch repeats，DGR）以及CTR4个部分组成［5］。其中，Keap1的DGR区可分别与Nrf2Neh2区的DLG基序和ETGE基序结合，即1分子Nrf2可以结合2分子Keap1，同时DGR区也是Keap1与胞浆内肌动蛋白结合的部位。Keap1的DGR区由6个重复的双甘氨酸序列形成一个“口袋”样结构与Nrf2Neh2区的DLG或ETGE基序结合，在Nrf2与Keap1结合时，1分子Keap1的DGR区与Nrf2 的DLG结合，另1分子Keap1的DGR区与Nrf2的ETGE基序结合，而这2分子Keap1会形成一个二聚体，Keap1的BTB区则参与Keap1二聚体的形成，并调节Nrf2与Keap1的结合［6］。当氧化应激时，由各种因素导致Keap1及其二聚体空间构象发生改变时，Nrf2即可与Keap1解离，继而入核发挥生物学功能。

2.2 Nrf2/ARE通路 ARE是位于一些保护性基因上游调节区的一个DNA-启动子结合序列，而Nrf2是这一序列的激活因子，当活化的Nrf2进入细胞核与Maf蛋白（包括MafG、MafK、MafF）结合成异二聚体后与ARE序列结合，使受ARE调控的基因开始转录，从而启动Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等保护性基因的表达［7-8］。ARE与Nrf2的这种结合不仅需要其与Maf蛋白结合形成二聚体，更重要的是Nrf2对氧化还原敏感，因此它们之间的这种结合较具专一性，这使得该通路成为机体抗氧化等防御机制中的重要通路。

2.3 生物学功能 Nrf2是目前发现在氧化应激时最为重要的转录因子，它参与细胞氧化应激等多种防御机制，从而在炎症、肿瘤等疾病的发生发展中扮演重要角色。它启动抗氧化基因的表达以及诱导Ⅱ相解毒酶的产生在机体对抗氧化、亲电子以及外源性毒物损伤过程中起到决定性作用［9］。Nrf2 与ARE结合继而启动了下游抗氧化基因的转录，在这个过程中，ARE被Nrf2结合并激活是较具专一性的，这使得Nrf2在机体防御尤其是抗氧化过程中至关重要，因而最终作为抗氧化、解毒、抗炎、抗肿瘤等防御机制中的重要靶点。

3 Nrf2/ARE通路的调节

3.1 Nrf2/ARE通路的激活

3.1.1 Nrf2/ARE通路的正常生理激活 正常状况下，锁定1个分子Nrf2的Keap1二聚体与E3泛素连接酶形成复合物，介导Nrf2的泛素化降解［10］。当应激时，Nrf2的磷酸化、Keap1中对氧化还原敏感的半胱氨酸残基特别是Cys257、Cys273、Cys288、Cys293被修饰以及Keap1构象发生改变，使得Nrf2的低亲和力位点DLG与Keap1发生解离，而另一个结合基序ETGE由于亲和力高仍与Keap1结合，这一变化恰巧阻止了Nrf2的降解，当Keap1被饱和后，新合成的Nrf2进入核内与ARE结合，启动目标基因的转录，即Nrf2/ARE通路被激活。这就是铰链和锁存模型［11］。而激活Nrf2/ARE通路的途径除了使Keap1构象改变，释放Nrf2入核外，还通过Keap1的降解来增强这一信号通路。某些miRNA如miRNA200a可以作用于Keap1 mRNA的3′-UTR使得Keap1的mRNA降解［12］，也有报道称氧化及电离辐射应激时，Cul3依赖的泛素化会由Nrf2转移至Keap1，使得Keap1自身发生降解，Nrf2得以释放，启动Nef2/ARE通路［13］。Nrf2与Keap1结合主要依靠其高亲和力结合基序ETGE，而含有ETGE基序的这一类物质如PALB2则通过阻断Keap1与Nrf2的结合对Nrf2/ARE通路进行正向调节。最近也有报道称某些抑癌蛋白也可通过与Keap1结合来激活Nrf2/ARE通路［14］。

3.1.2 Ⅱ相酶诱导剂介导的Nrf2/ARE通路激活 5，6-二氢环戊烯-1，2-二硫杂环戊烯-3-硫酮（5，6-dihydrocyclopenta-1，2-dithiole-3-thione，CPDT）及萝卜硫素（sulforaphane，SF）等Ⅱ相酶诱导剂可以快速升高Nrf2的浓度，进而增强Nrf2的转录活性，但它们并不调节Nrf2基因的转录以及Keap1的表达。同时，它们也不引起Nrf2-Keap1及泛素化酶复合体的解离；相反，它们都能抑制Nrf2的磷酸化以维持Nrf2与Keap1的结合。研究表明，它们主要是通过进入细胞核，在核内抑制Nrf2蛋白酶体降解以维持其蛋白稳定性这种方式来增强Nrf2的转录活性［15］。但CPDT与SF在Keap1敲除的细胞中又没有升高Nrf2的能力，由此推断它们是通过Keap1依赖和非依赖两种方式调节Nrf2的活性［16］。

3.1.3 其他与Nrf2/ARE通路激活有关的因素 研究发现Nrf2的基础骨架和亮氨酸拉链区域分别含有1个核定位信号和1个核输出信号，Neh5区域上含有1个氧化敏感的核输出信号，这些发现表明Nrf2可能自发地响应外界信号，非Keap1依赖地入核执行转录功能［17］。

3.2 Nrf2/ARE通路的负向调节

3.2.1 Keap1介导的Nrf2/ARE通路负向调节 在Nrf2/ARE通路的负向调节中最主要的就是Keap1这一因素，它不仅将Nrf2锁定在胞浆内，还通过泛素化对Nrf2进行快速降解，对于细胞内Nrf2水平的稳态起巨大作用。此外，Keap1也可以在应激诱导后通过阻断Nrf2与ARE的结合来抑制Nrf2/ ARE通路的激活。Keap1对Nrf2的抑制作用在Nrf2/ARE通路的负向调节中占主导地位。越来越多研究发现，许多miRNA参与Nrf2/ARE的负向调节。譬如，miR-144在MLL （myelogenous leukaemia）细胞株中可以抑制Nrf2 mRNA的表达［18］，miR-28a在乳腺上皮细胞中可以靶向作用于Nrf2mRNA的3′-UTR，引起Nrf2 mRNA的降解，从而负向调节Nrf2/ARE通路［19］，这些都是直接作用于Nrf2从而达到负向调节作用的。

3.2.2 核因子（NF）-κB介导的 Nrf2/ARE通路负向调节 NF-κB和Nrf2均在机体的免疫和抗氧化调节中发挥着重要的作用，当NF-κB信号通路激活时，Nrf2信号通路会受到抑制。已有研究表明，NF-κB的p56亚基强烈抑制Nrf2的转录活性，并且p56的C-端转录激活区对于p56的反抑制功能是必不可少的，但与其激活靶基因的能力无关，P56抑制Nrf2与Keap1不同，它主要是从两个层面来影响Nrf2的活性，一是抑制Nrf2与MafK的二聚化来直接导致DNA的结合能力减弱；另一方面是抑制Nrf2-CREB的相互作用，CREB协同参与Nrf2对目标基因转录活性的增强，p56通过与Nrf2竞争结合CREB从而间接的抑制了Nrf2的转录活性［20］。这一研究发现为针对NF-κB介导的促炎、促肿瘤提供了新的治疗途径。

3.2.3 转录抑制因子介导的Nrf2/ARE通路负向调节 Nrf2需要与Maf蛋白形成异二聚体后才可与ARE结合，而现研究发现体内广泛存在的转录抑制因子Bach1在某种程度上存在与Nrf2竞争性结合Maf蛋白的现象，从而可以在Nrf2 与ARE结合这一环节阻遏这一抗氧化通路的启动，参与Nrf2/ARE通路的负向调节［21］。

综上所述，Nrf2/ARE通路是体内重要的抗氧化、抗炎、抗肿瘤通路，但最近也有文献报道其促使了肿瘤的生长［22］，对其通路的调节成为疾病生物化学治疗的一个重要靶点。目前尚未得到Nrf2的蛋白晶体结构，而其蛋白空间结构可能有助于更好地研究Nrf2及其介导的信号通路，同时也可以采用生物信息学方法对可能与Nrf2/ARE通路有相互作用的物质，如miRNA、化学药物等进行计算机模拟并做出预测，从而有效地缩短筛选该通路调控分子的时间。

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（2014-08-11收稿 2014-10-20修回）

（本文编辑 李国琪）

Research progress of Nrf2/ARE pathway regulating mechanism

YI Xiaofang，TAN Chao△
The First Clinical Medical College，Three Gorges University，Yichang 443002，China
△Reviser E-mail：yczxyytanchao@sina.com

Nuclear factor E2 related factor Nrf2 is a nuclear transcription factors involved in a variety of protein expression.As a center of oxidative stress regulation，it combines with antioxidant components（antioxidant responsive element，ARE）and activates downstream multiple anti-oxidation，anti-inflammatory and detoxifying enzyme protein expression.This signaling pathway is involved in the development of inflammation，tumor and other pathological process.This review describes the basic structure，biological effects and signaling pathways of Nrf2，summarizes the latest progress about mechanisms of factors，which are involved in the positive and negative regulations of signal pathway，providing a new target for antiinflammatory，antioxidant，and antitumor biochemical treatment.Based on these，the paper also looks forward to applicating bioinformatics technology and providing better prospects for the development of target intervention.

Nrf2；Nrf2/ARE signal pathway；oxidative stress

R392.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.032

湖北宜昌，三峡大学第一临床医学院检验科（邮编443002）

易小芳（1976），女，本科，主管技师，从事生殖免疫方面研究

△审校者 E-mail：yczxyytanchao@sina.com