纠正EDTA依赖性假性血小板减少的方法学研究进展

姜树朋(综述)，李　艳(审校)

(武汉大学人民医院检验科， 武汉 430060)

检测医学

纠正EDTA依赖性假性血小板减少的方法学研究进展

姜树朋△(综述)，李艳※(审校)

(武汉大学人民医院检验科， 武汉 430060)

摘要：乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)是国际血液学标准化委员会建议的血细胞计数抗凝剂，其在应用过程中偶尔会发生EDTA依赖性假性血小板减少症(EDTA-PTCP)。为了防止临床误诊误治，导致不必要的血小板输注，必须对血小板计数进行纠正。目前纠正方法主要有稀释模式法、替代抗凝剂法、微量离心管法、药物稳定法、网织红细胞通道法、血小板计数参考方法等。

关键词：乙二胺四乙酸二钾依赖性假性血小板减少症；乙二胺四乙酸二钾；血小板计数

乙二胺四乙酸二钾(ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium，EDTA-K2)作为血细胞计数抗凝剂，对血细胞计数影响小，其抗凝的原理是与血液中的钙离子结合形成螯合物，进而使钙离子失去活性，从而阻止血液凝固[1]。但是，在偶然的情况下，EDTA-K2可诱导血小板中的特殊蛋白使血小板发生凝集，全自动血细胞分析仪不能识别，导致检测的血小板计数明显低于实际数值，这就是EDTA依赖性假性血小板减少症(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)[2-5]。EDTA-PTCP本身虽无任何病理学意义，但由于发生率低而极易被忽视，导致临床误诊误治，甚至有可能进行不必要的血小板输注。同时，EDTA-PTCP的存在可以掩饰真正的血小板减少。因此，选择科学可行的纠正检测方法是十分必要的。现对目前国内外纠正EDTA-PTCP的方法学研究进展予以综述。

1EDTA-PTCP的临床特点

临床上，EDTA-PTCP的发生率低，为0.09%~0.21%[6]，虽然患者EDTA抗凝血在血细胞分析仪上检测时，血小板计数明显低于正常值，但是其凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间等凝血功能以及可引起血小板减少的疾病的相关检查指标(如血尿酸、肌酐、抗核抗体、抗心磷脂抗体以及补体C3、C4等)均在正常范围内。同时，患者并无出血、呕血、黑便、血便等出血倾向，无任何自身免疫系统疾病、血小板疾病家族史以及使用抗血小板药物、输血、放疗、化疗等相关病史。

临床上，若患者符合上述特点，应考虑EDTA-PTCP的可能性。实验室检查时，如出现人工血小板计数高于血细胞分析仪测定值的3~10倍，且血细胞分析仪检测的血小板减少随标本抽取时间的延长而持续下降，则应高度怀疑EDTA-PTCP。此时应立即行显微镜检查，若发现血小板聚集成堆，可以诊断为EDTA-PTCP[7]。 EDTA-PTCP可见于肿瘤、自身免疫性疾病、肺源性心脏病(肺心病)、晚期妊娠、肝病、毒血症及一些不明原因的疾病患者[8]。

2EDTA-PTCP的发生机制

目前，EDTA-PTCP的发生机制仍未完全明确，其中相对确定的是，EDTA-K2作为抗凝剂，可出现免疫介导的冷抗血小板自身抗体，这种EDTA抗凝剂依赖的冷抗血小板抗体可直接作用于血小板的膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，这种抗体的FC端可与单核细胞或淋巴细胞膜上的FC受体结合，出现卫星现象，时间越长聚集越严重[9-10]。因此，在全自动血细胞分析仪上进行血细胞计数时会出现血小板假性减少。

3EDTA-PTCP情况下血小板计数的纠正方法

当出现EDTA-PTCP时，须对血小板计数进行纠正。国内外尚无统一的纠正方法，目前常用的纠正方法主要有以下几种。

3.1稀释模式法对疑似EDTA-PTCP样本再取样：采静脉血40 μL置于360 μL的血细胞分析仪稀释液中，用10×75的塑料试管盛装，血细胞分析仪稀释模式检测，需注意的是从采血到检测须在5 min内完成[11]，否则随时间的延长，血小板检测值逐渐下降。该方法虽然结果准确、简单，且费用低，但是在实际工作中，住院患者如要在抽血后5 min 内完成血常规检查有一定的困难。

3.2替代抗凝剂法对发生EDTA-PTCP的样本，大部分的观点是改用枸橼酸钠抗凝，以排除血小板聚集的影响，进而得到准确的血小板计数。邝妙欢等[12]采用枸橼酸钠抗凝，在10 min内观察血涂片，有76.9%血小板未发生聚集，采用仪器测量的血小板的平均值较手工法检测的更符合美国临床实验室改进修正法规 88的标准[13]。因此，对于存在EDTA-PTCP 的样本，可用枸橼酸钠抗凝样本后，在10 min内用仪器计数血小板数值。但是，有报道EDTA-PTCP患者的血液标本用枸橼酸钠抗凝后，个别病例还是会发生聚集[14]。

3.3微量离心管法外周静脉血瑞姬染色观察到血小板聚集，未见血小板散在分布后，将少量用真空管采集的标本混匀后倒入微量离心管中，适度振荡并保持平均血红蛋白水平、红细胞平均血红蛋白水平以及红细胞平均体积变化不超过1.5%，重新测定血小板[15]，所得数据用SPSS分析。该方法虽然可以得出较为准确的结果，但步骤繁琐、可控性差。

3.4药物稳定法文献报道，在EDTA抗凝血中加入氨基糖苷类抗生素、磷酸吡哆醛、氨茶碱等可能防止血小板凝集[16-19]。

阿米卡星，又称丁胺卡那霉素，是一种氨基糖苷类抗生素。巫小莉等[20]研究证实，在2 mg/mL的EDTA-K2抗凝血中加入5 mg/mL丁胺卡那霉素能使患者的血小板在4 h内保持稳定，血涂片中的血小板无聚集现象。

赵丽艳等[21]亦证明，氨基糖苷类抗生素硫酸阿米卡星具有防止EDTA-PTCP患者血小板聚集以及解离已聚集的血小板的作用，并进一步指出：硫酸阿米卡星加入到EDTA-K2样本的时间不同，其对血小板的解离作用也是不同的，30 min内加入硫酸阿米卡星能完全解离已聚集的血小板，涂片镜检可见血小板散在分布且形态正常；而30 min后加入，随采血后时间的延长，血小板聚集的程度加重，解离效果减弱，检测显示血小板数逐渐减少。该实验提示阿米卡星加入的时机十分重要，超过30 min再加入，则不能使聚集的血小板发生解离。这样的处理适用于临床血常规标本的检测，且对正常血标本的血小板、白细胞及红细胞计数无明显影响。但以上实验结果仅是对1例EDTA-PTCP患者进行1年多的随访研究得来，样本量太小、可靠性差。

近来又出现EDTA-PTCP患者应用阿米卡星无效的病例[22]，张景全等[22]对2例EDTA-PTCP患者进行研究发现，将6.5 mg/mL的阿米卡星加入到2 mg/mL的EDTA-K2抗凝血中进行血小板计数纠正时，阿米卡星并不能立即解离2例患者聚集的血小板。但是，随着时间的延长，聚集的血小板缓慢解离，在4 h后达到相对稳定，在1 h内加入阿米卡星可以获得理想结果。在放置时间很短的情况下，EDTA使血小板的形态发生改变，形成可逆性凝集体，全血细胞分析仪检测时，血小板计数下降；随着放置时间延长，EDTA使缠绕的血小板解散， 此时检测血小板计数增加。其中1例患者的抗凝血在4 h后显微镜检测时，仍能观察到部分血小板聚集，考虑为放置时间依赖合并温度依赖的假性血小板减少。

综上所述，阿米卡星并非对所有的EDTA-PTCP均会立即起效，需区别对待。

3.5网织红细胞通道法EDTA-K2抗凝血在XE-2100全自动血细胞分析仪网织红细胞通道检测的血小板计数结果较为可靠[23]。这是由于核酸染液在对网织红细胞中的颗粒进行染色时，也对血小板进行了染色，再经散射光和荧光判断，即可得到血小板的数量。这种方法既不会把大血小板划入红细胞中，也不易将红细胞碎片误认为是血小板。因此，经网织红细胞通道检测的血小板计数可作为EDTA-PTCP患者实际血小板数量，但检测费用会有所增加。

3.6参考方法目前国际血液学标准化委员会推荐的血小板计数的参考方法为流式细胞仪法[24]，其原理是利用免疫荧光素标记特异的血小板单克隆抗体，用流式细胞仪计数血小板。该方法虽然精确，但是步骤复杂、检测费用高，不宜临床推广应用。

4小结

EDTA-K2作为抗凝剂应用于全血细胞的分析已日益普遍，但其不适用于计数临床确诊的EDTA-PTCP患者的血小板。对于血小板的纠正检测，应具体问题具体分析，在保证检测质量的前提下，使用不同的纠正方法，及时给临床最可靠以及最有价值的检验结果。另外，引起EDTA-PTCP的具体机制仍需进一步的研究，以明确EDTA-PTCP的原因。血小板计数方法相关流程的改进以及避免误诊的发生是检验科未来应该考虑的问题和研究方向。

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Research Development of Correction Methodology of EDTA-dependent PseudothrombocytopeniaJIANGShu-peng,LIYan.(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract:EDTA-K2 is taken as the proposed anticoagulant in blood count by International Council for Standardization in Hematology(ICSH).However,occasionally EDTA-dependency pseudothrombocytopenia (EDTA-PTCP) occurs.In order to prevent clinical misdiagnosis,mistherapy and unnecessary platelets transfusion,it is necessary to correct the platelet count.At present the main correction methods are dilution model method,alternative anticoagulant method,micro centrifuge tube method,drug stability method,reticulocyte count method,channel PLT reference method etc.

Key words:EDTA-dependent pseudothrombocytopenia; Ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium-K2; Platelet count

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-01-28编辑：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.045

中图分类号R446.11

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)17-3194-02