2种不同成牙本质诱导液对大鼠脂肪干细胞增殖凋亡的影响＊

吴娟娟，田 芳，宋 琦，李 萍，赵彩霞，魏 丹

（遵义医学院附属口腔医院病理科，贵州遵义563003）

脂肪干细胞（adiposed-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞［1］。研究发现脂肪基质细胞（ADSC）能够在体外直接增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获得大量干细胞、对机体损伤小、来源广泛、体内储存量大等优点，逐渐成为近年来新的研究热点。口腔组织工程学领域也将ADSCs作为具有发展潜力的种子细胞。虽然，种子细胞很重要，但诱导液的选择也不容忽视，就目前来说，干细胞向成牙本质样细胞方向分化的诱导液使用得较多的有2种［2－3］：一种为成牙本质诱导液－牙胚条件培养液（tooth germ cell conditioned medium，TGC-CM），另一种为牙本质非胶原蛋白（dentin non-collagenous protein medium，DNCPM）。牙胚是由上皮与间充质细胞相互作用而形成。TGC-CM［4］就是利用啮齿类动物切牙根尖区一种特殊的上皮结构会不断地生长，其周围间充质的功能与出生前牙乳头的功能相似，含有多种分子信号和生长因子，这一特性对干细胞向成牙本质样细胞进行诱导分化。而DNCPM［5］是由牙本质特异性蛋白、矿化组织特异性蛋白、生长因子及蛋白多糖组成。有研究［6］证实牙本质非胶原蛋白单独作用或与一些细胞因子共同作用能够诱导牙髓干细胞、牙髓细胞，甚至是胚胎干细胞向成牙本质样细胞分化。随着口腔组织工程学的发展，多种干细胞向成牙本质样细胞分化的报道屡见不鲜，但诱导液在细胞培养过程中的作用却未见报道。本实验旨在利用2种不同诱导液作用脂肪来源干细胞，对细胞的增殖及凋亡进行检测，以筛选出更利于优秀种子细胞存活的诱导条件。

1 材料与方法

1.1 材料 出生后4d的SD乳鼠（遵义医学院实验动物中心提供），DMEM／F12培养基（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），Ⅰ型胶原酶（Sigma公司），透析袋（MW：8 000～14 400），兔抗鼠-CD44、兔抗鼠-CD105（北京中博奥森生物技术有限公司），羊抗兔SP法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），凋亡检测试剂盒（BD公司），MTT（北京华美生物工程公司），0.4%台盼蓝染色剂（碧云天生物科技有限公司），CKX-41倒置相差显微镜（Olympus公司），全波长酶标仪（Thermo Scientific公司），FACS calibur流式细胞仪（BD公司），DMLB2HC图像分析及采集系统（LEICA公司）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干细胞的分离及培养 取出生后4d的SD乳鼠4只，引颈处死，浸于75%乙醇消毒10min，解剖切取双侧腹股沟皮下脂肪组织，剪碎成1mm3的组织块，用含1%双抗的PBS液清洗3次，加入等体积0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，在37℃，5%CO2培养箱中消化30～45min。往消化好的组织块中加入2倍体积的PBS液反复吹打混匀，200目筛网过滤形成单细胞悬液，1 200r／min离心5min，倒去上清液，反复2次。以5×105／mL密度接种于培养瓶中，置于培养箱中培养，24h后首次换液去除未贴壁的细胞，待细胞贴壁80%左右时，用胰蛋白酶消化以1∶2或1∶3进行传代。

1.2.2 脂肪干细胞的鉴定 第2代脂肪干细胞长满约80%时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液。以每孔5×104个细胞接种于6孔板内的盖玻片上，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁后，PBS液冲洗5min×3次，用4%多聚甲醛在室温下固定30min，严格按照SP试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色，一抗终浓度为1∶500的CD44与1∶500的CD105。

1.2.3 TGC-CM 及 DNCPM 的制备 TGC-CM 的制备：牙胚细胞来源于原ADSCs来源动物的下颌切牙牙胚，剪碎后以0.1%Ⅰ型胶原酶消化1h，200目细胞筛过滤后，1 100r／min离心6min，用PBS液和不含血清培养基各洗1次后，接种至100mL培养瓶中，取培养至第3、5、7天的原代牙胚细胞上清液，以22μm一次性过滤器过滤，高速离心机2 000r／min离心20min，取上清与基础培养液以1∶1混匀制成TGC-CM。DNCPM的制备：取3个月SD大鼠10只，钳取上下切牙后用生理盐水洗净，去髓。冰浴下磨去釉质和牙骨质，切成小段于铜质研钵中捣成粉末，浸入10%EDTA-5mM PMSF（pH＝7.2）液中2d，上清液移至透析袋中扎紧，加入双蒸水于烧杯中透析，透析后的液体分装于离心管中，置于冷冻真空干燥机中真空干燥，DNCPM收集称质量备用。

1.2.4 2种诱导液作用脂肪干细胞后的增殖情况 第2代于生长对数期的脂肪干细胞常规消化后制成细胞悬液，以4.5×106／mL密度接种于96孔板，每孔100μL，置于培养箱中贴壁后，将细胞分为3组：对照组、TGC-CM组、DNCPM组。加入相应的诱导培养液100μL，对照组加入等量的基础培养基，每组设5个复孔，培养72h，于培养结束前4h每孔加入20μL 0.5%MTT液，培养4h后，用针头小心吸去液体，各孔再分别加入150μL DMSO溶解结晶，轻摇10min，酶联免疫检测仪490nm处检测各孔的OD值。实验重复3次。

1.2.5 2种诱导液作用脂肪干细胞后的凋亡情况 将于生长对数期的第2代脂肪干细胞常规消化后接种于6孔板中拍样，设TGC-CM组、DNCPM组及对照组。各组设3个复孔，待细胞贴壁后加入对应的诱导液，对照组加入同等剂量的基础培养液。培养72h后，分别消化收集细胞（包括贴壁细胞和悬浮细胞），PBS洗2次，收集洗液，以2 000r／min离心8min，重复洗2次后，每孔细胞加入100μL×Binding Buffer重悬，移至流式管，加入5μL FITC AnnexinV及5μL PI荧光抗体，并设染色对照，涡旋混匀，避光条件下孵育10min，于1h内流式细胞仪检测凋亡情况。实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态 未经诱导的第2代ADSCs经7～9d生长后，多数呈多角形或纤维状，细胞核清晰，一般有2～3个核仁，见较多核分裂相，呈鱼群状或旋涡状分布，细胞界限不清楚（图1）。经TGC-CM诱导3d后，细胞增殖能力较强，呈较长的纤维状，细胞质丰满，细胞核变大，部分细胞开始出现极性改变，细胞有平行排列的趋势（图2）。经DNCPM培养3d以后，细胞形态已发生明显改变，胞体变宽，呈较大的多角形，部分开始出现极性改变，细胞核大，位于细胞的一端，细胞以单极或2个突起为主，旋涡状或放射状分布开始改变，趋向于平行排列（图3）。经TGC-CM培养6d后，ADSCs细胞极性更加明显，多数细胞呈平行排列，细胞形态与纤维形牙胚细胞相似；经0.4%台盼蓝染色，细胞计数后发现细胞数量没有明显变化（图4）。经DNCPM培养6d后，ADSCs细胞极性趋势明显，突起变得多而长，细胞核大而明显，细胞质内富含蛋白分泌颗粒，细胞大致平行排列；细胞计数后发现细胞数量明显减低（图5）。

图1 未经诱导的第2代ADSCs（×100）

2.2 免疫细胞化学染色 经免疫细胞化学法鉴定脂肪干细胞表面标记抗原CD44、CD105均为阳性表达（图6～7）。

2.3 诱导后细胞的增殖情况 ADSCs经 TGC-CM 和DNCPM培养72h，其增殖率间接由OD值来反映，DNCPM组OD值低于对照组和TGC-CM组，差异有统计学意义（P＜0.05），TGC-CM 组与对照组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），见表1。

图2 经TGC-CM诱导3d的ADSCs（×100）

表1 2种诱导液作用大鼠脂肪干细胞后的增殖与凋亡情况（±s）

表1 2种诱导液作用大鼠脂肪干细胞后的增殖与凋亡情况（±s）

＊：P＜0.05，与对照组比较；▲：P＜0.05，与 TGC-CM 组比较；△：P＞0.05，与对照组比较。

组别 A490OD值 凋亡率（%）0.380±0.125 5.311±2.414 TGC-CM组 0.377±0.035△ 4.020±2.380△DNCPM组 0.028±0.017＊▲ 11.060±2.712对照组＊▲

图3 经DNCPM诱导3d的ADSCs（×100）

图4 经TGC-CM诱导6d的ADSCs（×100）

2.4 诱导后细胞的凋亡情况 ADSCs经TGC-CM和DNCPM培养72h后，DNCPM组的凋亡率高于对照组与TGC-CM组，差异有统计学意义（P＜0.05），TGC-CM组凋亡率与对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图1。

图5 经DNCPM诱导6d的ADSCs（×100）

图6 CD44阳性表达（SP法，×200）

图7 CD105阳性表达（SP法，×200）

图8 ADSCs诱导后流式凋亡散点图

3 讨 论

牙齿再生是治疗牙体缺失最具前景的方法。脂肪来源干细胞的分化潜能随年龄的增长保持不变［7］，这是脂肪来源干细胞相对于其他种子细胞的一大突出优势。Hung等［8］研究证实，脂肪干细胞与牙髓干细胞均能在家兔模型中分化发育为具有神经和血管的完整牙齿，但脂肪干细胞具有更高的生长率且不易衰老。因此，本实验选其作为主要的研究对象，并从SD乳鼠中成功分离提取细胞并在体外繁殖。Alipour等［9］用免疫荧光检测到来源于人剥脱的乳牙和脂肪中干细胞的表面标记物发现，2种细胞均表达CD44，而脂肪干细胞表面还可表达CD105分子。本实验通过免疫组织化学采用CD44和CD105为检测标记物，并得到双阳性的结果，说明从大鼠脂肪组织中获取的细胞为脂肪干细胞。

通过细胞观察，2种诱导液在作用ADSCs 3d后，细胞发生极性改变，表型也开始与原来的细胞明显不同，细胞可能开始发生定向分化。细胞的增殖和分化能力高低取决于其微环境是否适宜。Yu等［10］使用TGC-CM成功地将牙髓干细胞诱导为牙髓牙本质复合体并证明TGC-CM能够为牙本质的形成提供微环境，是介导牙髓干细胞形成规则牙本质的有效方法。TGC-CM能够诱导干细胞向牙本质方向分化的原因是在其作用的微环境中存在着调节的分子信号和生长因子如Notch-1、TGF-βs、BMPs、FGFs，能参与牙本质形成中的信号转导和调控。而DNCPM组成成分中的唾磷蛋白在牙本质矿化中具有重要作用，糖胺多糖能促进牙本质细胞的极化，同时也含有一些生 长 因 子 如 TGF－βs、BMP-2、BMP-3、BMP-7 等。Deng等［11］证实第一鳃弓来源的间充质细胞能在 DNCPM 或DNCPM＋TGF-β1诱导下分化为成牙本质样细胞。Wen等［12］使用牙囊条件培养液与DNCPM混合后诱导脂肪干细胞分化为成牙骨质样细胞，与此同时诱导后的成牙骨质细胞很快就丧失了增殖能力。这也与本研究观察到的情况是符合的，DNCPM与ADSCs共培养6d后，细胞的数量就开始发生明显地减少。2种诱导剂均能够诱导脂肪干细胞形成牙样组织，但它们对细胞生长的影响的比较却未见报道。本实验将TGCCM与DNCPM单独作用于脂肪来源干细胞，并将诱导后细胞的增殖情况和凋亡率在各组之间进行比较，以此作为细胞生长状态的评估。经TGC-CM诱导后的细胞增殖率与凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明在诱导中TGCCM并没有影响细胞的正常生长。但与TGC-CM组相比，DNCPM组增殖率明显降低，凋亡率增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。这可能是DNCPM本身或在提取过程中产生的某些成分影响了细胞的增殖并诱导凋亡。而在TGC-CM的细胞培养上清液中，包含了保持细胞增殖活力的各种细胞因子、基质蛋白、细胞代谢物，更利于细胞的生长。由此可以推断，TGC-CM可能对种子细胞向成牙本质样细胞的诱导更具优势。

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