三聚氰胺致泌尿系结石的动物模型研究进展

石红霞，杨淑芬，张长荣(综述),陆　晨※(审校)

三聚氰胺致泌尿系结石的动物模型研究进展

石红霞1△，杨淑芬2，张长荣2(综述),陆晨2※(审校)

摘要：2008年9月我国发生三聚氰胺污染婴幼儿奶粉所致婴幼儿泌尿系结石事件，致使三聚氰胺的毒理学安全性受到公众广泛关注。国内外大量研究发现，长期大剂量摄入三聚氰胺不仅可引起泌尿系结石，还可造成肾功能异常甚至肾衰竭。建立三聚氰胺结石动物模型是研究疾病病因、致病机制及制订治疗方案的有效方法。该文就三聚氰胺致泌尿系结石的动物模型以及三聚氰胺致肾结石动物模型的特点予以综述。

关键词：三聚氰胺；结石；动物模型

三聚氰胺是德国化学家在1834年首次合成的一种重要的氮杂环有机化工染料，其不仅可用于涂料、塑料、纺织、医药等，也可作为阻燃剂、减水剂和甲醛清洁剂，还可合成药物的中间体或药物载体原料等；三聚氰胺俗称蛋白精，其含氮量很高(66%)，在凯氏定氮法中可表现出高蛋白质水平的假象，并且生产工艺简单、成本低廉[1-2]。因此就有不法商家通过在人类食品、宠物食品、家畜饲料中添加三聚氰胺，以提升含氮量，替代蛋白质(如2007年的宠物饲料事件与2008年的三鹿奶粉事件)[3-4]。2008年我国近30万食用添加有三聚氰胺的三鹿奶粉的婴幼儿发生泌尿系结石、肾衰竭甚至死亡[4]。鉴于该事件对我国食品安全产生的影响，因此有必要设计和建立与人类三聚氰胺导致尿石症相类似的动物模型，为探讨三聚氰胺致泌尿系结石的形成机制、指导临床治疗及筛选抗结石的药物、预防和延缓结石形成等方面提供科学依据。

1三聚氰胺致结石的动物实验模型探讨

三聚氰胺是一种具有轻微毒性的化工原料；国际化学品安全卡提到，长期或反复大量摄入含三聚氰胺的食品，可能对肾与膀胱产生危害，最终会导致泌尿系统结石的形成[5]。大量的研究也发现，连续大剂量使用三聚氰胺可导致泌尿系结石的发生[6-8]。三聚氰胺引起的泌尿系结石按形成部位分为肾结石、膀胱结石、输尿管结石，但有时摄入三聚氰胺形成的结石也可同时在两个部位出现[5-8]。

1.1三聚氰胺致肾结石的动物模型在工业生产过程中，三聚氰胺可逐步水解生成三聚氰酸，因而三聚氰胺原料中常常掺杂有少量的三聚氰酸。三聚氰胺本身为低毒性，一般情况下进入成年人体内的三聚氰胺大部分可自行排出；但如果该物质在肾内与其类似物三聚氰酸结合则会形成难以溶解的氰尿酸三聚氰胺化合物，并在此基础上形成结石而堵塞肾小管，导致肾功能损害[9]。杨海东等[7]探讨三聚氰胺及其类似物(三聚氰酸)致肾结石动物模型的建立，将大鼠分为对照组和实验组，并根据每只大鼠每日进食三聚氰胺和三聚氰酸量的不同,将实验组分为3组，对照组每日给予羧甲基纤维素钠灌胃；实验观察到，对照组大鼠肾皮质及髓质无结晶形成；实验组给予不同剂量三聚氰胺及其类似物后，各组大鼠肾脏病理切片均有结晶形成,但其中一组采用三聚氰胺及三聚氰酸灌胃的量为每日121 mg/kg连续灌胃1周,能成功建立三聚氰胺及其类似物(三聚氰酸)肾结石动物模型且动物病死率低、易操作，结石形成周期短、重复性好；该研究说明，三聚氰胺及其类似物(三聚氰酸)可引起动物肾结石。梁毅文等[8]对三聚氰胺及三聚氰酸导致肾脏损害的机制进行研究也发现，两者联合对大鼠进行灌胃会在肾脏形成一种晶体，堵塞肾小管，造成肾脏损害甚至急性肾衰竭；而且实验还发现，两者同时混合注入导致大鼠出现低pH值尿、高尿酸血症，这些因素会增加尿结石的发生率并进一步诱发结石。2007年Puschner等[10]和2008年Dobson等[11]的动物研究也都证明了三聚氰胺和三聚氰酸联合摄入会导致大量晶体堵塞肾小管，最终导致肾结石形成。2008年，有学者对猫、犬、猪和鱼等动物进行三聚氰胺毒性实验，同时给予三聚氰胺和三聚氰酸，发现动物肾脏出现含有三聚氰胺和三聚氰酸的复合晶体，提示肾结石形成，继而出现肾衰竭[12-14]。2011年，吴德生等[15]对三聚氰胺联合三聚氰酸经口28 d染毒对大鼠肾脏进行观察，发现肾脏出现结晶现象，提示有肾结石产生。Baynes等[16]对5只猪单独使用三聚氰胺的实验结果表明，三聚氰胺本身能轻易从肾脏排泄。有些学者的研究证实，单独使用三聚氰胺或三聚氰酸不会对肾脏产生毒性作用，同时还发现两者在一定浓度内不会影响肾脏功能；但混合摄入则会使机体产生大量的难溶性晶体，沉积在肾小管，使大鼠发生急性肾衰竭而导致死亡[10-11]。以上研究表明，三聚氰胺或三聚氰酸单独使用对肾脏没有毒性，但混合使用不仅可以形成肾结石还可导致肾脏的损伤甚至肾衰竭及死亡。长期高浓度摄入三聚氰胺或三聚氰酸可致肾结石、肾脏损害等，在既往国外的动物实验及国内的研究中都得到了证实[17-18]。

1.2三聚氰胺致膀胱结石的动物模型邹移海等[19]通过动物实验表明，用工业原料三聚氰胺连续给药可诱发SD大鼠形成膀胱结石；研究还观察到，在给药第20日、第30日时，各组大鼠的肾脏未见结石和沉淀形成,但有部分大鼠膀胱黏膜充血,并出现膀胱结石；其中给药第20日、第30日各组有50%以上大鼠出现淡黄色与白色混合或白色的膀胱结石；实验说明低剂量，即0.05～0.4 g/kg三聚氰胺连续给药30 d,可诱发大鼠产生膀胱结石。此后，邹移海等[20]继续研究发现，以0.5～2.5 g/kg剂量的三聚氰胺给大鼠灌胃20 d，仅有部分大鼠出现膀胱结石。由于工业原料三聚氰胺含杂质较多，不但不利于分析结石成分，也不利于三聚氰胺动物模型的规范化造模。陈嘉等[21]为了探讨三聚氰胺形成泌尿系结石机制进行了化学纯三聚氰胺膀胱结石大鼠模型的研究，实验结果显示，以每日给药0.5、0.7、0.9 g/kg剂量组在第30日时形成膀胱结石比例最高，且均为雄性大鼠，这和临床上泌尿系结石多发生在男性患者的情况相符，主要是因为男性尿道与女性尿道的生理构造不同，相对于女性而言，男性尿道较长而窄，易形成结石。此实验结果表明，化学纯三聚氰胺易使大鼠形成膀胱结石，并且每日0.5 g/kg是一个比较理想的建立大鼠膀胱结石模型的剂量。

1.3三聚氰胺致输尿管结石的动物模型邹移海等[20]观察三聚氰胺连续给药20 d诱发SD大鼠膀胱结石的情况，实验分为6组，其中5组为给药组，另1组为空白对照组；采用体视显微镜观察到各组大鼠给药第20日输尿管结石发生率为93%，且以0.5～2.5 g/kg三聚氰胺连续给药20 d，易诱发部分SD大鼠产生输尿管结石。张薇[22]的研究也证实，三聚氰胺可诱发SD大鼠输尿管结石形成；实验还发现，各组大鼠在给药第10日、第20日时膀胱结石发生率为9%、37%,且给药第20日各组大鼠输尿管结石发生率为93%；实验说明，高剂量三聚氰胺连续给药不仅诱发大鼠产生输尿管结石，还可出现膀胱结石甚至于肾脏形成沉淀物，最终导致肾脏出现结石。这一高剂量三聚氰胺可使泌尿系统各部位发生结石的研究结果与Ogasawara等[23]的实验结果相似。

2三聚氰胺肾结石动物模型与传统的肾草酸钙结石动物模型的比较

传统的尿结石动物模型主要有草酸钙结石模型、磷酸钙结石模型、尿酸结石模型等[24]。Robertson等[25]早在1978年就提出了泌尿系结石形成危险因子的概念,含钙结石有尿钙、尿草酸、尿pH、尿酸、尿量和尿酸性黏多糖6项危险因子。在泌尿系结石中，大多为草酸钙结石，对于草酸钙结石，其危险因子主要为尿钙和尿草酸[24]。长期大量摄入三聚氰胺以及尿草酸都可引起泌尿系结石(如肾结石、膀胱结石)，并且损伤泌尿系统，但两者导致尿结石的动物模型在造模方面、引起的动物泌尿系统损害、结石晶体性状方面是有差异的，而又以致肾结石模型较为显著[22-25]。

2.1造模方面肾草酸钙结石造模方法包括增加尿草酸排泄量和损害肾小管上皮两大类。目前大鼠肾草酸钙结石模型造模的基础诱石剂是乙二醇，因为乙二醇有增加尿草酸排泄的作用[24]。研究表明，肾小管细胞的损害有利于晶体的滞留及生长，使用肾小管上皮细胞毒性剂有利于造模；而氯化铵是常用的肾毒性药物，长期服用可造成肾小管功能损害，促使草酸钙晶体形成[26]。因此，在设计肾草酸钙结石动物模型时不仅要形成高草酸尿，而且要使草酸钙晶体滞留在肾脏。de Water等[27]乙二醇+氯化铵联用给大鼠灌胃28 d后发现，肾皮质、髓质有晶体沉积。另外，草酸结晶的形成另一必需要素为尿钙的排泄增加，辅以其他一些诱因(如高钙饮食)以促使大鼠形成肾结石[24]。甘澎等[28]用乙二醇+氯化铵给大鼠灌胃，并联合应用葡萄糖酸钙腹腔注射后，成石效果优于乙二醇+氯化铵以及乙二醇+葡萄糖酸钙腹腔注射。而三聚氰胺肾结石在造模方面无需添加肾毒性药物及辅以高钙饮食，采用不同剂量三聚氰胺灌胃实验动物，联合其类似物三聚氰酸灌胃，低剂量及高剂量三聚氰胺连续灌胃都可形成肾结石，但研究所选用的剂量过大会造成肾毒性较大导致动物死亡快，从而影响动物模型的建立[19-21]。

2.2肾脏损害方面de Water等[27]用乙二醇+氯化铵给大鼠连续灌胃28 d后，观察到肾皮质、髓质有大量草酸钙晶体沉积，而且有肾小球硬化、肾小管萎缩，还有间质纤维化等肾脏损害。国内亦有研究者用乙二醇联合氯化铵给大鼠灌胃28 d后，观察到大鼠肾脏可见炎性细胞浸润及肾组织变性坏死[28]。国内还有学者用三聚氰胺及其类似物每日121 mg/kg、181 mg/kg剂量灌胃1周，可引起大鼠血肌酐、尿素氮高于参考值范围；并且观察到肾脏有结晶形成，结晶体阻塞肾小管，从而导致动物出现急性肾功能不全；且用每日181 mg/kg剂量灌胃的大鼠肾脏纤维增生、炎性细胞浸润及肾小球破坏的病理表现更为严重[7]，其原因可能与晶体形成较大造成了肾小管的撕裂有关[29]。沉积在肾脏的晶体会逐渐积聚增大，会严重堵塞肾小管，进而造成肾单位的破坏甚至会引起急性肾衰竭[7]。

2.3晶体性状有研究用乙二醇+氯化铵给大鼠灌胃，并联合应用钙剂腹腔注射造模的草酸钙结石模型，14 d后对肾组织苏木精-伊红染色用显微镜观察到，肾皮质、肾髓质、肾乳头有大量无色透明结晶体形成，形状不规则且折光性较强，团簇状沉积甚至聚集成片[28]。而曹正国等[30]的研究发现，对鼠肾组织常规病理切片HE染色后，草酸钙晶体在镜下显示为不规则的淡蓝色晶体；Von-Kossa′s染色后，草酸晶体呈现黑褐色。柴玮杰等[31]进行了三聚氰胺致大鼠肾损伤模型的研究，观察到模型组在低倍镜下可见肾组织散在点、片状棕褐色结晶；高倍镜下可见结晶系为扇形或圆形结构呈放射状排列。

3小结

三聚氰胺尿结石动物模型是研究尿结石形成的重要手段，长期大剂量摄入三聚氰胺不仅可导致泌尿系结石，还可引起泌尿系统的损害，尤其是对肾脏损伤最大，甚至会造成肾衰竭。通过对三聚氰胺尿结石动物模型的研究有助于了解三聚氰胺的危害及尿结石形成过程，为筛选防治结石药物、确定防治计划及改善预后等提供帮助。但目前如何有效治愈三聚氰胺泌尿系结石、延缓泌尿系结石的复发并预防其形成，仍是一个亟待解决的问题。这不仅需要医学还需要动物学、生物学和化学等学科的研究工作者共同努力。

参考文献

[1]Friedel B，Greulich-Weber S.Preparation of monodisperse,submicrometer carbon spheres by pyrolysis of melamine-formaldehyde resin[J].Small，2006，2(7)：859-863.

[2]Lund KH，Petersen JH.Migration of formaldehyde and melamine monomers from kitchen-and tableware made of melamine plastic[J].Food Addit Contam，2006，23(9)：948-955.

[3]Lang L.FDA issues statement on diethylene glycol and melamine food contamination[J].Gastroenterology，2007，133(1)：5-6.

[4]国家卫生部新闻办公室.卫生部通报三鹿牌婴幼儿奶粉事件医疗救治工作情况[EB/OL].(2008-12-01)[2009-07-07].http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohbgt/s3582/200812/38386.html.

[5]王娟娟，陈凯，朱小蕾．“宠物毒粮”中的假冒蛋白质-三聚氰胺[J]．化学教育，2008，29(8):4-5.

[6]Hau AK，Kwan TH，Li PK．Melamine toxicity and the kidney[J]．J Am Soc Nephrol，2009，20(2)：245-250.

[7]杨海东，陈戬，刘建和，等.三聚氰胺及其类似物致大鼠肾结石动物模型建立[J].昆明医学院学报,2010，31(3)：24-27.

[8]梁毅文，于永刚，刘刚，等.三聚氰胺及三聚氰酸致大鼠肾脏损害的研究[J].华南国防医学杂志，2010，24(2)：130-133.

[9]Interim Safety and Risk Assessment of Melamine and its Analogues in Food for Humans.US Food and Drug Administration-Center for Food Safety and Applied Nutrition[EB/OL].[2008-10-03].http://www.cfsan.fda.gov/～dms/melamra.html.

[10]Puschner B，Poppenga RH，Lowenstine LJ，etal.Assessment of melamine and cyanuric acid toxicity in cats[J].J Vet Diagn Invest，2007，19(6)：616-624.

[11]Dobson RL，Motlagh S，Quijano M，etal.Identification and characterization of toxicity of contaminants in pet food leading to an outbreak of renal toxicity in cats and dogs[J].Toxicol Sci，2008，106(1)：251-262.

[12]Cianciolo RE，Bischoff K，Ebel JG，etal.Clinicopathologic,histologic and toxicologic findings in 70 cats inadvertently exposed to pet food contaminated with melamine and cyanuric acid[J].J Am Vet Med Assoc，2008，233(5)：729-737.

[13]Thompson ME，Lewin-Smith MR，Kalasinsky VF，etal.Characterization of melamine- containing and calcium oxalate crystals in three dogs with suspected pet food-induced nephrotoxicosis[J].Vet Pathol，2008，45(3)：417-426.

[14]Reimschuessel R，Gieseker CM，Miller RA，etal.Evaluation of the renal effects of experimental feeding of melamine and cyanuric acid to fish and pigs[J].Am J Vet Res，2008，69(9)：1217-1228.

[15]吴德生，刘建军，徐新云，等.三聚氰胺联合三聚氰酸经口28 d染毒对雌性SD大鼠体重与肾脏的影响[J].安徽农业科学，2011，39(12)：7275-7277.

[16]Baynes RE，Smith G，Mason SE，etal.Pharmacokinetics of melamine in pigs following intravenous administration[J].Food Chem Toxicol，2008，46(3)：1196-1200.

[17]Melnick RL，Boorman GA，Haseman Jk，etal.Urolithiasis and bladder carcinogenicity of melamine in rodents[J].Toxicol Appl Pharmacol，1984，72(2)：292-303.

[18]贾广乐，王建峰，林祥梅，等.三聚氰胺等4种物质的毒性比较研究[J].中国畜牧兽医，2008，35(12):162-163.

[19]邹移海，张薇，徐志伟，等.三聚氰胺泌尿系统结石大鼠模型研究[J].中国比较学杂志，2009，19(7)：5-10.

[20]邹移海，张薇，张忠广，等.三聚氰胺诱发SD大鼠泌尿系结石初步观察[J].广州中医药大学学报，2009，26(1)：95-101.

[21]陈嘉，邹移海，张薇，等.化学纯三聚氰胺膀胱结石大鼠模型的研究[J].华南农业大学学报，2010，31(3)：81-84.

[22]张薇.三聚氰胺尿结石模型及中药三金汤干预作用研究[D].广州：广东中医药大学，2009.

[23]Ogasawara H，Imaida K，Ishiwata H，etal.Urinary bladder carcinogenesis induced by melamine in F344 male rats:correlation between carcinogenicity and urolith formation[J].Carcinogenesis，1995，16(11)：2773-2777.

[24]叶章群，邓耀良，董诚.泌尿系结石[M].北京：人民卫生出版社，2003：7-109.

[25]Robertson WG，Peacock M，Heyburn PJ，etal.Risk factors in calcium stone disease of the urinary tract[J].Br J Urol，1978，50(7):449-454.

[26]Kumar S，Sigmon D，Miller T,etal.A new model of nephrolithiasis involving tubular dysfunction/injury[J].J Urol，1991，146(5)：1384-1389.

[27]de Water R,Noordermeer C，van der Kwast TH，etal.Calcium oxalate nephrolithiasis：effect of renal crystal deposition on the cellular composition of the renal interstitium[J].Am J Kidney Dis，1999，33(4)：761-771.

[28]甘澎，王树声，向松涛，等.改良大鼠肾草酸钙结石模型与传统模型的比较[J].中国中医急症，2010，19(6)：1004-1006.

[29]Brown CA，Jeong KS，Poppenga RH，etal.Outbreak of renal failure associated with melamine and cyanuric acid in dogs and cats in 2004 and 2007[J].J Vet Diagn Invest，2007，19(5):525-531.

[30]曹正国，刘继红，段永芳，等.集中实验性大鼠肾草酸钙结石模型的比较研究[J].华中科技大学学报，2002，31(5)：556-559.

[31]柴玮杰，王玉燕，高珉之，等.三聚氰胺致大鼠肾损伤模型的研究[J].畜牧兽医科技信息，2009，6(6)：18-19.

Research Progress in Animal Model of Urinary Calculi Caused by Melamine

SHIHong-xia1,YANGShu-fen2,ZHANGChang-rong2,LUChen2.

(1.DepartmentofGraduate,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China; 2.DepartmentofNephropathy,People′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001,China)

Absract：The infant urinary calculi caused by melamine contaminated infant milk powder occurred in China in September 2008 has aroused the public attention on the safety and toxicology of melamine.A large number of domestic and foreign studies found that long-term intake of large doses of melamine not only can cause urinary calculi,but also can result in abnormal kidney function and even kidney failure.To establish animal model of melamine is an effective method to study the disease etiology,pathogenic mechanism,and develop therapeutic regimens.Here is to make a review of the literature on the characteristics of the animal models of melamine-induced urinary calculi and kidney calculi.

Key words：Melamine； Calculi； Animal model

收稿日期：2014-04-10修回日期：2014-08-05编辑：郑雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.007

中图分类号：Q95-33

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)04-0593-03

基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目(200933121)
(1.石河子大学医学院研究生处，新疆 石河子832000； 2.新疆维吾尔自治区人民医院肾脏病科，乌鲁木齐830001)