SET8在细胞周期中的研究进展

郭佳倩，马仕昆(综述)，郑　英(审校)

(扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室，江苏 扬州 225001)

SET8在细胞周期中的研究进展

郭佳倩△，马仕昆△(综述)，郑英※(审校)

(扬州大学医学院组织学与胚胎学教研室，江苏 扬州 225001)

摘要：SET8是现今发现唯一能够特异性单甲基化组蛋白H4第20位赖氨酸(H4K20)的赖氨酸甲基转移酶。单甲基化H4K20和SET8的含量在细胞周期的不同时相中发生动态变化，这种动态变化调节了细胞周期的进程。在G1/S过渡期SET8通过泛素E3连接酶SCF/skp2复合物泛素化而降解。SET8和单甲基化H4K20在S期处于低表达，这与E3泛素连接酶复合物CRL4cdt2高活性有关。SET8和单甲基化H4K20的表达在G2/M期达到高峰。主要是由于SET8的S29磷酸化抑制了SET8的降解。SET8的异常表达会导致细胞周期阻滞。

关键词:SET8；细胞周期；单甲基化H4K20

组蛋白的甲基化修饰是一种重要的翻译后修饰，这种修饰参与了多种生理过程，对于维持正常的生命活动具有重要的意义。组蛋白的甲基化修饰主要是由一类含有SET结构域的蛋白来执行。组蛋白H4第20位赖氨酸(H4K20)特异性甲基转移酶包括多细胞生物SET8、果蝇ASH1、鼠科动物NSD1、哺乳动物SUV4-20H1/2，这些酶都是含有SET结构域的甲基转移酶家族的成员，可以催化蛋白质中的赖氨酸进行甲基化。SET8又称PR-SET7、SETD8、KMT5a，是现今发现唯一能够特异性单甲基化H4K20的赖氨酸甲基转移酶。SET8和单甲基化的H4K20在保持基因稳定性、调节细胞周期、染色体浓缩、转录、调节染色体结构、染色体沉默、肿瘤发生和个体发育中都发挥着重要作用[1-5]。现主要对SET8和甲基化H4K20在细胞周期G1、G1/S过渡期、S期、G2/M期中的调节作用进行总结。

1H4K20甲基化与SET8

组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白,是一类小分子碱性蛋白质,有5种类型：H1、H2A、H2B、H3和H4。H4K20的甲基化分为3个层次：单甲基化、二甲基化和三甲基化。这3个甲基化层次是由不同的酶催化完成，H4K20的单甲基化是由酶SET8完成，而它的二、三甲基化是由酶Suv4-20h1/h2、核受体结合SET 域蛋白1(NSD1)和ASH1完成[6]。也有研究发现在酵母中，包含不典型SET结构域的蛋白Set9负责H4K20的单、二和三甲基化[7]。H4K20甲基化的3个层次之间可能有相互作用，有实验表明缺乏SET8会导致单甲基化的H4K20的减少，同时也会导致H4K20二甲基化和三甲基化的明显减少，这很可能是SET8催化的单甲基化的H4K20是Suv4-20h1/h2的作用底物[2]。所以当剔除Suv4-20h1/h2时，H4K20二甲基化和三甲基化水平降低，单甲基化的H4K20含量也相应增加，但目前尚未有实验证实。

SET8是现今发现的唯一能够特异性单甲基化H4K20的赖氨酸甲基转移酶，只在多细胞生物体内表达。人SET8 mRNA全长2765 bp，编码蛋白质含352个氨基酸。蛋白质序列分析发现在217-343aa含有一个进化上高度保守的SET结构域，能够特异性地单甲基化修饰H4K20。研究表明，SET结构域对于SET8具有甲基转移酶的活性是至关重要的，将其第299位氨基酸突变后，SET8甲基转移酶的活性将大大降低。除了SET结构域外，SET8的C末端9个氨基酸及紧邻SET结构域N端的42个氨基酸对SET8蛋白的甲基转移酶活性也有极大的影响[8]。Yin等[7]研究也发现，SET8的第195～352位氨基酸区域与SET8蛋白全长一样能够发挥甲基转移酶活性。同时发现，SET8的SET结构域识别和甲基化H4K20需要H4NT(histone 4 N-Terminal)的核心序列RHRK20VLRDN，点突变RHRK20VLRDN中任何一个氨基酸都会导致SET8的SET结构域识别和甲基化H4K20的作用丧失或大大降低。这说明SET8识别和甲基化H4K20需要氨基酸序列RHRK20VLRDN和SET8的SET结构域相互作用。

2SET8在细胞周期不同时相中的研究

2.1G1期在G1期，SET8和单甲基化的H4K20含量都维持在较低的水平。实验表明，剔除SET8会导致单甲基化的H4K20同步缺失，在这些细胞中，G1期细胞含量有明显的降低[9]。暗示了缺乏SET8和单甲基化的H4K20会导致细胞周期阻滞。在哺乳动物细胞中，通过免疫荧光法研究显示，当细胞周期从有丝分裂期回到G1期时，SET8的水平下降。这可能是由泛素E3连接酶SCF/skp2介导的泛素化所引起的[6],因此H4K20单甲基化水平也随之下降。相反，总H4K20二甲基化和三甲基化水平在G1期是最高的，然后逐渐开始下降[9]。这种现象是否说明H4K20单甲基化是H4K20二、三甲基化的作用底物尚未确定。

文献报道，SET8的组蛋白结合域(histone-blinding domina,HBD)与H4末端相互作用，使SET8缺乏蛋白水解的位点而在G1期积累。在G1期，过表达SET8的HBD而非全长SET8会减少组蛋白H4第5、8、12位氨基酸的乙酰化最终阻碍细胞周期进程进入S期。另外，过表达SET8的HBD而非全长SET8的也阻碍了微小染色体维持复合物在复制起始的形成[10]。

2.2G1/S过渡期与已知的细胞周期标记分子(p21、cyclinD、cyclinE及cyclinA)相比，内源性SET8在G1/S过渡期时急剧下降，然后在S期早期SET8逐渐出现低水平的表达。现已知，在G1/S过渡期，一些细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk)抑制因子，如p21可通过被泛素化修饰而降解。实验表明,SET8可以被同样的过程降解,即在G1/S过渡期，SET8可通过被SCF/skp2复合物泛素化修饰而降解。研究表明,通过使用si-RNA使skp2基因沉默，破坏了SCF/skp2复合物的形成，结果SET8的含量在G1/S过渡期未降低，反而有少量的增加；而在对照组中，G1/S过渡期SET8含量显著低于G1期，由此可以得出结论，在G1/S过渡期,SET8通过SCF/skp2复合物泛素化而进行降解[11]。

SET8有两个独立的功能域：SET结构域和HBD，前者负责单甲基化的催化活性；后者负责将SET8蛋白结合到H4。SET8与H4结合的前提是H4NT第5、8、12位氨基酸的未乙酰化。由于HDB突变的SET8不会被降解，因为正如前文提到的HBD与H4末端相互作用，使得SET8缺乏蛋白水解的位点，并且HDB突变的SET8可以将SET8一直绑定到H4NT，这可以阻止H4NT第5、8、12位氨基酸的乙酰化和阻止DNA复制。过表达SET8的HBD可以阻碍DNA复制，表明过表达SET8的HDB阻碍了DNA复制和进入S期。因此可以得出结论：SET8是通过控制H4NT氨基酸残基的乙酰化负性调控DNA复制[11]。

综上所述，SET8的HBD将SET8绑定到H4NT，这可以抑制SET8的降解和H4NT氨基酸残基的乙酰化，进而导致进入S期阻滞和DNA复制抑制，因此SET8必须在G1/S过渡期被降解，从而使细胞周期顺利进入S期。

2.3S期

2.3.1SET8在S期的表达SET8和单甲基化的H4K20在S期一直维持在一个较低的水平，甚至在S期检测不到SET8。SET8和单甲基化H4K20的低表达与E3泛素连接酶复合物CRL4cdt2高活性有关。SET8和H4K20单甲基化的表达模式和p21、Cdt2非常相似，这两种细胞周期调节因子是CRL4cdt2泛素连接酶泛素化的作用底物。实验表明，S期单甲基化H4K20表达的降低是伴随着SET8水平的降低，而SET8水平降低是因为通过CRL4cdt2泛素连接酶泛素化而使SET8降解，这种降解需要SET8与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)相互作用和活跃的蛋白酶体共同作用[12]。剔除人细胞中的CRL4cdt2会导致SET8稳定化和异常的H4K20单甲基化在S期中堆积。在S期SET8可通过CRL4cdt2泛素连接酶泛素化而降解，它需要识别SET8高度保守的PIP盒。实验表明,PIP盒突变的SET8(SET8ΔPIP) 在S期不能被降解[12-13]。SET8ΔPIP表达会导致在S期H4K20me1水平提高、触发细胞周期检查点介导的G2期阻滞和DNA损伤。对这种现象有不同的解释，一个研究团队发现,SET8ΔPIP会诱导不成熟的单甲基化H4K20的堆积和核染色质的压缩[13]。而另一个团队研究发现,SET8ΔPIP会导致组蛋白基因抑制，进而会使5种组蛋白蛋白表达缺失，SET8在S期的稳定化会导致组蛋白基因抑制[12]。研究表明，三个序列元素共同构成了“PIP盒”，依次是典型的PIP盒、PIP盒5和6位置的TD模序、PIP盒下游的第4位氨基酸残基。实验表明，SET8的PIP盒的序列被完好地保存在广泛的多细胞生物体中。这对于绑定PCNA是至关重要的[13]。而PIP盒有PIP1和PIP2两个基序。将两个PIP模序进行突变和用环己酰亚胺追踪实验来研究哪个PIP基序参与到SET8降解中，结果表明相比于野生型，突变PIP2导致SET8稳定性增加，而突变PIP1不会改变SET8的稳定性，同时观察到SET8和PCNA相互作用高度依赖于PIP2而不是PIP1。因此，PIP2基序是PIP盒的功能区，对于泛素化和降解SET8是必需的[14]。PCNA和SET8相互作用才能引起CRL4cdt2泛素连接酶泛素化所介导的SET8的降解，从而使SET8在S期维持在一个低水平。SET8在S期的降解是以CRL4cdt2依赖的方式，尽管如此实验还观察到在人细胞中，SET8ΔPIP还是会以低速率降解，表明不依赖于PIP盒的降解方式也有助于SET8的减少[13]。而另一组实验表明，SET8被CRL4cdt2识别降解不仅需要PIP盒中的氨基酸也需要PCNA中的氨基酸。通过共结晶结构等实验发现,PCNA的两个保守的酸性残基D122、E124对于CRL4cdt2介导的降解是至关重要的，表明PCNA的残基是直接参与到泛素连接酶降解底物的过程中的[15]。这些结构提示，PCNA在CRL4cdt2识别底物的过程中发挥直接作用。

正如前文所述的，在G1/S过渡期SET8被降解后，细胞周期才能顺利进入S期开始DNA复制，在S期SET8和单甲基化H4K20一直维持在一个较低的水平，甚至检测不到SET8。然而矛盾的是，低水平的SET8仍然在S期发挥着重要作用，缺乏SET8会降低复制叉的活性，缺乏SET8和PCNA相互作用会阻滞S期进程，但目前还不清楚SET8在S发挥作用的机制。有一种猜测是SET8在DNA复制中的功能是否依赖于它的下游被Suv4-20h1/h2所催化的H4K20me2/3水平，因为考虑到H4K20me2/3在G1和S期含量较高，在野生型小鼠胚胎成纤维细胞中表达非降解性SET8突变体(nondegradable PR-Set7 mutant,PR-Set7PIPM2)导致细胞生长速度明显减少，但是PR-Set7PIPM2在Suv4-20h1/h2缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞中则是无效的。这些结果表明，在S期由SET8稳定性增加导致的细胞周期进程缺陷是依赖于Suv4-20h和它的产物H4K20me2/3[16]。结合H4K20me2/3在S期是高表达的，猜测SET8在S期的作用是通过它的下游H4K20me2/3而发挥作用的。而这仍待进一步实验验证。

2.3.2SET8在S期中的作用细胞周期S期主要是完成DNA复制。一种SET8促进S期进程的机制是这样阐述的，有实验表明PCNA是SET8的相互作用蛋白，进一步实验证明它们相互作用是通过SET8的N端实现的，表明SET8被募集到复制焦点是通过绑定PCNA，这个过程需要一个假定的“PIP盒”。含羞草素阻滞和释放试验表明SET8和PCNA相互作用对于S期进程是十分重要的[17]。基于监测DNA复制动力学试验表明，缺乏SET8会导致复制叉移动速率降低，而这种复制叉移动速率的降低会用增加活跃复制叉密度来弥补，这样细胞就可以绕过基于缺乏SET8而导致的S期阻滞，这些结果都表明复制焦点缺乏SET8会影响复制的进程，会导致DNA中断和DNA损伤应答增加，从而导致S期延迟[6]。而另一种SET8促进S期进程的机制是剔除SET8会导致在复制期间特异性DNA损伤，这会诱导Chk1介导的S期检查点。SET8对于保持哺乳动物细胞基因稳定性是必需的，减少SET8的表达会导致DNA损伤和Chk1依赖的S期阻滞。使用人骨肉瘤U2OS细胞转染干扰小RNA来下调SET8表达，抑制SET8的表达会导致大量S期细胞堆积，Western blotting实验表明剔除SET8的细胞被阻滞在S期，也就是说正常的S期进程需要SET8。组蛋白H3丝氨酸10的磷酸化作用是有丝分裂细胞的一个标记，它的水平在剔除SET8的细胞中相比于正常细胞低，表明DNA复制在剔除SET8的细胞中被损害，导致了S期延迟。S期延迟在剔除SET8的细胞中是由Chk1介导的。Chk1是静止的复制叉诱导细胞反应的关键调节器，这种反应会导致DNA复制在复制开始时被抑制，抑制SET8的表达会导致大量的Chk1激活。剔除SET8后出现DNA损伤也同时激活了Chk1。激活的Chk1具有检查点激酶的活性，可导致SET8剔除的细胞发生细胞周期延迟。为了进一步证实，在剔除SET8的细胞中使用干扰小RNA来特异性长期降低Chk1的表达。缺乏SET8的细胞抑制Chk1后可以阻止S期延迟。由此推测，正常的S期进程需要SET8，抑制SET8的表达会导致Chk1活性增强，Chk1依赖的DNA复制抑制，最终导致S期延迟[18]。

2.4G2/M期单甲基化H4K20在G1和S期都维持一个较低的水平，而在G2/M期达到峰值，相反，二、三甲基化的H4K20在G2/M期是整个细胞周期中含量相对较低。这样的发现暗示了只有H4K20单甲基化是限制在G2/M期，相比于其他H4K20甲基化修饰，单甲基化修饰在细胞周期中可能具有独特的作用。而出现这种现象的原因目前还不清楚[9]。正如前文所述，由H4K20me1和H4K20me2/3水平的比较，猜测单甲基化的H4K20是H4K20进行二、三甲基化的作用底物，但目前还没有确切的证据证明这一点。

丝氨酸29(S29)是SET8磷酸化主要位点，并且是 cdk1/cyclinB复合物特异性和有选择性的磷酸化位点。同时S29磷酸化并不影响SET8的活性。cdk1/cyclinB介导的SET8 S29磷酸化主要发生在有丝分裂前期到后期。SET8 S29磷酸化是在G2期SET8和H4K20me1积累之后出现的。但在细胞分裂后期到末期迅速减少。因此，cdk1/cyclinB介导的SET8 S29磷酸化主要发生在前期和早后期。S29磷酸化抑制了APCcdh1泛素复合物介导的泛素化和SET8的降解，使SET8在有丝分裂前期到后期维持在一个较高的水平，SET8在后期的快速降解是因为Cdc14的脱磷酸化作用，脱磷酸化的SET8可以被泛素化和降解[19]。SET8在G2/M的含量的变化与其他的研究发现也是一致的，SET8在有丝分裂前期到后期都维持在较高的水平，而在有丝分裂末期SET8含量迅速下降，然后维持在低水平回到G1期[20]。

3展望

SET8对于正确的细胞周期进程是至关重要的，并且SET8的含量在细胞周期中不断地变化，跟随SET8变化的是H4K20me1的水平，调节SET8在细胞周期中的水平是由多种因素共同作用的。但是,具体SET8在细胞周期中作用的机制还尚不明确，仍然需要进一步研究。H4K20me2/3的作用底物是否是H4K20me1。SET8和H4K20me1发挥作用是否也需要H4K20me2/3的参与。SET8的异常调节会导致细胞周期异常，从而影响多种生命活动过程，引起机体的异常和疾病的发生，进一步明确SET8和H4K20在细胞周期中的作用机制可以为临床相关疾病的诊断及治疗提供新的思路。

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The Research Progress of SET8 in the Cell Cycle

GUOJia-qian，MAShi-kun，ZHENGYing.

(DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou225001,China)

Abstract:SET8 is the sole enzyme known to specially catalyze monomethylation of histone H4 lysine 20.The level of H4K20me1 and SET8 are dynamically changed in different stages of cell cycle,which regulates the cell cycle processing.At G1/S transition,SET8 is degraded through ubiquitination via SCF/skp2 complex.During S phase,the low level of SET8 and H4K20me1 is related to high activity of CRL4cdt2.The level of SET8 and H4K20me1 reach peak during G2/M phase,because phosphorylation of S29 of SET8 inhibits the degradation of SET8.The abnormal expression of SET8 can result in the cell cycle arrest.

Key words:SET8； Cell cycle； H4K20me1

收稿日期：2014-04-15修回日期：2014-07-21编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金(31371174)；江苏省自然科学基金(BK 20131230)；江苏省2014年度普通高校研究生科研创新计划项目( KYLX_1363)；扬州市社会发展科技攻关计划(2012127)；2014年度扬州大学新世纪人才工程

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.004

中图分类号：R34；Q555

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)04-0585-04