免疫共刺激分子PD-1与PD-L1在乳腺癌中的表达及意义

张　亚，彭成浩

(1.无锡市第九人民医院病理科，江苏 无锡 214000； 2.枣庄市立医院肿瘤研究所，山东 枣庄 277000)

免疫共刺激分子PD-1与PD-L1在乳腺癌中的表达及意义

张亚1，彭成浩2※

(1.无锡市第九人民医院病理科，江苏 无锡 214000； 2.枣庄市立医院肿瘤研究所，山东 枣庄 277000)

摘要：目的探讨免疫共刺激分子程序性死亡分子1(PD-1)及其配体PD-L1在乳腺浸润性导管癌的表达及意义。方法收集2012年1月至2015年1月枣庄市立医院和无锡市第九人民医院经手术及病理诊断证实为乳腺浸润性导管癌且临床资料完整的患者67例，采用免疫组织化学法检测PD-1 和PD-L1在乳腺乳腺浸润性导管癌组织及癌旁组织中的表达，进一步分析PD-1和PD-L1的表达与患者年龄、发病时月经状态、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理参数的关系。结果乳腺癌组织中PD-L1与PD-1的阳性率分别为70.2%(47/67)和70.2%(47/67)，其癌旁组织中PD-L1 与PD-1的阳性率分别为32.8%(22/67)和62.7%(42/67)。不同肿瘤的组织学分级、肿瘤大小及淋巴结转移与否的PD-L1和PD-1的阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌肿瘤组织分化程度越低，PD-L1和PD-1的表达阳性率越高；出现淋巴转移的乳腺癌患者癌组织中PD-L1 和PD-1表达率明显高于未出现淋巴转移者(P<0.05)；肿瘤越大，乳腺癌组织中PD-L1和PD-1的表达阳性率越高。结论PD-1和PD-L1在乳腺癌组织中呈高表达，与肿瘤的侵袭转移关系密切，是预后差的重要指标之一，有望成为乳腺癌治疗的新靶点。

关键词：乳腺癌；程序性死亡分子1及其配体；临床病理；预后；治疗靶点

全球乳腺癌发病率自20世纪70年代开始逐年增高，我国乳腺癌的发病率近年来明显上升，严重危害女性身心健康。近年来兴起的免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗后的一种新的肿瘤有效治疗手段。针对人类表皮生长因子受体2(human epithelial growth factor receptor 2,Her-2)异常扩增的靶向药物赫赛汀的广泛应用，使一部分Her-2过表达型乳腺癌患者明显获益。然而，仍有许多患者如三阴性乳腺癌对激素及赫赛汀等治疗反应差，预后不良。研究显示，程序性细胞死亡分子1(programmed cell death 1,PD-L1)是新近发现的B7家族的免疫调节分子(B7 homolog 1,B7-H1)，具有免疫正性刺激作用，其配体为白细胞分化抗原28(cluster differentiation 28,CD28)家族成员的负性刺激受体PD-1[1]，广泛表达于多种免疫细胞、上皮细胞以及肿瘤细胞，主要与肿瘤的免疫逃逸关系密切[2]。近年来研究显示，人类许多肿瘤尤其是乳腺癌高表达免疫共刺激分子PD-L1，有望成为肿瘤治疗的新靶标[3-6]。目前，有关乳腺癌中PD-L1的系统研究国内报道较少。本研究应用免疫组织化学法检测PD-L1及其配体PD-1在乳腺浸润性导管癌及癌旁组织的表达，比较其表达水平与临床病理参数的关系,可望为寻找乳腺癌治疗的新靶点提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料收集2012年1月至2015年1月在枣庄市立医院和无锡市第九人民医院经手术及病理诊断证实为乳腺浸润性导管癌且临床资料完整的患者67例，年龄≤51岁30例，>51岁 37例；月经状态：未绝经43例，已绝经24例；肿瘤部位：外上+外下40例，内上+内下13例，中央区14例；组织学分级：Ⅰ级26例，Ⅱ级26例，Ⅲ级15例；淋巴结转移:阴性40例，阳性27例；肿瘤大小：直径≤2 cm 34例，2 cm<直径≤5 cm 27例，直径>5 cm 6例。每例患者均选取肿瘤组织和癌旁组织进行分析，癌旁乳腺组织取自67例乳腺癌患者距离癌组织2.5 cm以外的对应乳腺组织。

1.2实验方法67例乳腺浸润性导管癌肿瘤组织和癌旁组织标本均进行免疫组织化学检测PD-L1的表达。免疫组织化学检测采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法。实验操作严格按照说明书进行。4%甲醛固定，石蜡包埋组织2～3 μm常规切片，脱蜡至水，乙二胺四乙酸抗原修复液行抗原修复，过氧化氢处理，按说明书滴加相应抗体，采用二氨基联苯胺显色。即用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法免疫组织化学试剂盒、兔抗人PD-L1及PD-1抗体、浓缩型二氨基联苯胺显色试剂盒等所用试剂均购自福州迈新试剂有限公司。同时分析PD-1和PD-L1的表达与患者年龄、发病时月经状态、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理参数的关系。

PD-1和PD-L1细胞染色阳性表达为细胞膜和细胞质，呈清晰的棕黄色颗粒，细胞不着色或着色率<20%判断为阴性表达，细胞着色率≥20%判断为阳性表达[3]。

1.3统计学方法应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1临床病理特点67例乳腺浸润性癌均为女性，年龄30～78岁，中位年龄51岁；单侧乳腺发病者60例，双侧乳腺发病者7例；67例病例病理学检查证实为乳腺浸润性导管癌(封三图1)，癌旁乳腺组织经病理检查无肿瘤细胞浸润(封三图2)。所有患者术前未行放化疗或任何其他抗肿瘤治疗。

2.2PD-L1和PD-1在乳腺浸润性导管癌及癌旁组织中的表达免疫组织化学结果显示，67例乳腺浸润性导管癌组织中，肿瘤组织PD-L1分子阳性率为70.2%(47/67)，其癌旁组织中PD-L1阳性率为32.8%(22/67)，差异有统计学意义(χ2=18.67,P<0.05)(封三图3、图4)。

67例乳腺浸润性导管癌组织中，肿瘤组织PD-1分子阳性率为70.2%(47/67)，其癌旁乳腺组织中PD-1阳性率为62.7%(42/67)，差异无统计学意义(χ2=2.22,P>0.05)(封三图5、图6)。

2.3PD-L1和PD-1在乳腺癌组织中的表达水平与临床病理参数的关系不同年龄、发病时月经状态以及肿瘤部位PD-L1 和PD-1的阳性表达率比较差异无统计学意义(均P>0.05)；不同肿瘤的组织学分级、淋巴结转移情况、肿瘤大小的PD-L1 和PD-1的阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌肿瘤组织分化程度越低，PD-L1和PD-1的表达阳性率越高；出现淋巴转移的乳腺癌患者癌组织中PD-L1和PD-1表达率明显高于未出现淋巴转移者；肿瘤越大，乳腺癌组织中PD-L1和PD-1的表达阳性率越高。见表1。

a与Ⅰ级或5 d≤2 cm比较,P<0.05

3讨论

免疫共刺激分子PD-L1是在免疫应答中起重要作用的凋亡相关蛋白，能诱导T淋巴细胞与其配体PD-1结合后向T细胞传递抑制性信号出现凋亡，调节外周T细胞的免疫耐受，在机体抗肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用[1]。 近年来研究发现，PD-L1广泛表达于人类多种肿瘤组织中，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、肾癌等肿瘤组织微环境，能增加肿瘤反应性T淋巴细胞的凋亡和降低其免疫原性，与肿瘤的免疫逃逸关系密切，提示抗肿瘤免疫可能通过PD-1/PD-L1信号通路调控[2]。肿瘤组织中PD-1/PD-L1通路与肿瘤逃避免疫系统的破坏，是目前肿瘤研究中普遍关注的免疫治疗目标。用药物阻断PD-1/PD-L1通路能增强T细胞功能，引起肿瘤细胞裂解将为肿瘤治疗打开另一个新的窗口[3]。

研究显示，乳腺癌组织中PD-L1的表达水平与肿瘤的组织学分级相关[3-4]，有望成为继Her-2之后乳腺癌治疗的又一个新的免疫治疗靶标。本研究结果显示，67例乳腺浸润性导管癌组织中，肿瘤组织中PD-L1阳性率为70.2%，其癌旁组织中PD-L1阳性率为32.8%，差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤组织PD-1阳性率为70.2%，其癌旁组织中PD-1阳性率为62.7%，差异无统计学意义(P>0.05)，说明PD-1和PD-L1 在乳腺浸润性导管癌肿瘤组织中呈一致性高表达，进一步分析发现PD-1和PD-L1的表达与患者的肿瘤大小、组织学分级以及是否有淋巴结转移等临床病理参数相关。

PD-L1在肿瘤的免疫应答过程中对肿瘤细胞的增殖具有重要影响，同时在相当程度上弱化了肿瘤的免疫原性，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸，在肿瘤的侵袭和转移中发挥至关重要的正性刺激作用[3]。Chen等[5]研究发现，PD-L1在胃癌组织中的表达水平与肿瘤组织的浸润深度有关，同时PD-L1高表达的肿瘤细胞株的侵袭性高于PD-L1低表达细胞株。乳腺癌研究中，Ghebeh等[4]评估了44例乳腺癌组织中PD-L1表达水平与患者临床病理参数间的关系，发现PD-L1的表达并不局限于上皮乳腺组织也存在于淋巴细胞，与肿瘤大小、组织学分级、肿瘤浸润淋巴细胞、HER2/neu状态等相关预后因素关系密切，但与雌、孕激素受体的表达关系不大，认为PD-L1 可能是乳腺癌患者的重要危险因素之一。进一步研究显示，乳腺癌组织中PD-L1的表达与肿瘤细胞增殖之间直接关联[6]；同时乳腺癌组织中调节性T淋巴细胞的共表达PD-L1 和Foxp3也是一个预后差的指标[7]。Muenst等[8]研究也证实，乳腺癌组织中PD-L1的表达与预后差关系密切。Chawla等[9]认为PD-L1在乳腺癌细胞中异常表达，在肿瘤微环境中能招募调节性T细胞免疫逃逸，诱导肿瘤细胞高度增生而导致预后差，而化疗药物阿霉素能下调乳腺癌细胞表面的PD-L1的表达。Mittendorf等[10]研究认为，PD-L1可作为三阴性乳腺癌治疗的重要靶点。本研究结果显示，随着肿瘤大小的增加、分化程度的降低和淋巴结转移的出现，PD-L1和PD-1的表达率逐渐升高。推测由于PD-L1和PD-1的高表达促使肿瘤细胞的免疫逃逸，增加了增殖、侵袭和转移的机会，是值得深入研究的重要靶点。

综上所述，PD-L1作为B7家族的重要成员，以其独特的生物学功能在肿瘤免疫逃逸中发挥着重要作用，乳腺癌中PD-1与PD-L1的高表达与肿瘤的侵袭、转移关系密切，推测阻断PD-1/PD-L1通路可作为乳腺癌的潜在治疗靶点，尤其是对三阴性乳腺癌的治疗带来了新的希望。

参考文献

[1]Ostrand-Rosenberg S,Horn LA,Haile ST,etal.The programmed death-1 immune-suppressive pathway:barrier to antitumor immu-nity[J].J Immunol,2014,193(8):3835-3841.

[2]Soares KC,Rucki AA,Wu AA,etal.PD-1/PD-L1 blockade together with vaccine therapy facilitates effector T-cell infiltration into pancreatic tumors[J].J Immunother,2015;38(1):1-11.

[3]Hasan A,Ghebeh H,Lehe C,etal.Therapeutic targeting of B7-H1 in breast cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(10):1211-1225.

[4]Ghebeh H,Mohammed S,Al-Omair A,etal.The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma:correlation with important high-risk prognostic factors[J].Neoplasia,2006,8(3):190-198.

[5]Chen L,Deng H,Lu M,etal.B7-H1 expression associates with tumor invasion and predicts patient′s survival in human esophageal cancer[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):6015-6023.

[6]Ghebeh H,Tulbah A,Mohammed S,etal.Expression of B7-H1 in breast cancer patients is strongly associated with high proliferative Ki-67-expressing tumor cells[J].Int J Cancer,2007,121(4):751-758.

[7]Ghebeh H,Barhoush E,Tulbah A,etal.FOXP3+ Tregs and B7-H1+/PD-1+ T lymphocytes co-infiltrate the tumor tissues of high-risk breast cancer patients:Implication for immunotherapy[J].BMC Cancer,2008,8(8):57.

[8]Muenst S,Schaerli AR,Gao F,etal.Expression of programmed death ligand 1 (PD-L1) is associated with poor prognosis in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2014,146(1):15-24.

[9]Chawla A,Philips AV,Alatrash G,etal.Immune checkpoints:A therapeutic target in triple negative breast cancer[J].Oncoimmunology,2014,3(3):e28325.

[10]Mittendorf EA,Philips AV,Meric-Bernstam F,etal.PD-L1 expression in triple- negative breast cancer[J].Cancer Immunol Res,2014,2(4):361-370.

The Significance of Co-stimulatory Molecules PD-1 and PD-L1 Expression in Breast CancerZHANGYa1，PENGCheng-hao2.(1.DepartmentofPathology,WuxiNinthPeople′sHospital,Wuxi214000,China; 2.TumorResearchInstituteofZaozhuangMunicipalHospital,Zaozhuang277000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical significance and expression of co-stimulatory molecular PD-1 and PD-L1 in breast invasive ductal cancer.MethodsFrom Jan.2012 to Jan.2015 in Zaozhuang City Hospital and Wuxi Ninth People′s Hospital,67 patients after surgery with pathologic confirmed invasive ductal carcinoma with complete clinical data were included.The expression of PD-1 and PD-L1 were detected in the breast cancer tissue and adjacent normal breast tissue using immunohistochemistry.The relationship between the expression of PD-1/PD-L1 and clinical pathological parameters such as patients′ age,menstrual status,tumor size,pathologic grade,and lymph node metastasis were analyzed.Results PD-L1 and PD-1 positive rate in breast cancer tissue was 70.2%(47/67) and 70.2%(47/67) respectively,the PD-L1 and PD-1 positive rate of the cancer adjacent tissues were 32.8%(22/67) and 62.7%(42/67).PD-L1 and PD-1 expression rate of different histological gradings,tumor sizes and lymph node metastasis state was statistically significantly different(P<0.05).The lower the breast tumor tissue differentiation,the higher PD-L1 and PD-1 expression positive rate;PD-L1 and PD-1 expression in with lymph node metastasis was signifi-cantly higher than those without lymph node metastasis(P<0.05);the bigger the tumor size,the higher the PD-L1 and PD-1 expression positive rate.ConclusionThe expression of PD-1 and PD-L1 in breast cancer tissue is high,which is closely related to the tumor invasion and metastasis,and is one of the important indicators of poor prognosis,and is expected to become a new target for the treatment.

Key words：Breast cancer; Programmed death-1/programmed death-ligand 1; Clinical pathology; Prognosis; Therapeutic target

收稿日期：2015-05-28修回日期：2015-09-25编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.046

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4547-03