蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织PPARγ和NF-κB炎症信号途径表达的影响

翟凤国，李厚忠，周福波，林　峰，关利新

(牡丹江医学院药理学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织PPARγ和NF-κB炎症信号途径表达的影响

翟凤国，李厚忠，周福波，林峰，关利新※

(牡丹江医学院药理学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

摘要：目的探讨蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和核因子κB (NF-κB)炎症信号途径表达的影响，并进一步探讨其潜在的机制。方法将40只SD大鼠依据随机数字表法分为假手术组、模型组和蒺藜皂苷低剂量组和高剂量组，每组10只，采用线栓法制备大鼠脑缺血/再灌注损伤模型。脑缺血/再灌注24 h后检测大鼠神经功能损伤评分；酶联免疫吸附测定法检测大鼠脑组织NF-κB、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素(IL)1β的水平；免疫印迹法检测大鼠脑组织PPARγ蛋白表达水平。结果与模型组比较，蒺藜皂苷治疗低剂量组和高剂量组大鼠神经功能损伤明显减轻[(1.8±0.7)分、(1.3±0.5)分比(2.3±0.7)分]，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组NF-κB、TNF-α、IL-1β[(18.4±1.5) μg/mg、(916±128) pg/mg、(169±16) pg/mg]比较，蒺藜皂苷低剂量[(16.4±1.3) μg/mg、(257±110) pg/mg、(148±16) pg/mg]和高剂量组[(15.0±1.2) μg/mg、(665±72) pg/mg、(139±14) pg/mg]缺血脑组织NF-κB、 TNF-α和IL-1β水平明显降低(P<0.05)。结论蒺藜皂苷可能通过激活PPARγ的表达，进而抑制NF-κB炎症信号途径，抑制炎性因子的表达，降低炎症反应，从而减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤而发挥其神经保护作用。

关键词：脑缺血/再灌注；蒺藜皂苷；炎症；核因子κB；过氧化物酶体增殖物激活受体γ

缺血性脑血管疾病是严重危害人类健康的疾病之一，具有高发病率、高致残率的特点，是中老年人致死和致残的主要疾病。目前临床治疗主要通过溶解血栓和神经保护治疗两个途径。溶栓治疗疗效肯定，但受限于过窄的治疗时间窗(发病后6 h内)。尽管对脑缺血保护机制的研究不断深入，但目前所有的神经保护剂均处于实验阶段，尚缺乏治疗缺血性脑卒中疗效确切的药物，因此更多的研究转向具有天然活性的神经保护药物。蒺藜皂苷是从蒺藜草全草中提取的有效组分之一，是以甾体皂苷为主的十多种皂苷的混合物,临床主要用于心脑血管疾病的治疗。已有研究表明[1-2]，蒺藜皂苷对脑缺血损伤具有脑保护作用，但具体机制仍不明确，尤其是炎症反应的相关作用研究较少。本实验通过大脑中动脉缺血损伤模型进一步探讨蒺藜皂苷在脑缺血/再灌注损伤时脑保护作用的机制，从而为蒺藜皂苷临床治疗脑缺血损伤用药提供理论基础。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物健康清洁级雄性SD大鼠40只，体质量270～320 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[许可证号：SCXK(京)2012-0001]。所有大鼠常规饲料饲养，自由饮水和摄食，室内安静，每日光照12 h，室温控制在 20~25 ℃，相对湿度保持在(40±16)%。

1.1.2实验药品及主要试剂蒺藜皂苷由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，纯度>90%。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β) 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)多克隆抗体购自美国圣克鲁斯(SANTA CRUZ)公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及给药40只大鼠依据随机数字表法分为4个组，即假手术组、模型组、蒺藜皂苷高剂量组(30 mg/kg)和蒺藜皂苷低剂量组(10 mg/kg)，每组10只。给药组均于术前7 d灌胃给药，每日灌胃1次。模型组和假手术组给予相同体积的生理盐水。

1.2.2脑缺血模型的制备根据 Longa等[3]的线栓法加以改进，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，钝性分离左侧颈总颈内、外动脉，结扎颈外动脉。在颈外动脉近分叉处剪一“V”形切口，插入头端烧圆涂蜡呈钝形的直径为0.245 mm的尼龙鱼线，线栓插入深度为18～20 mm(距离颈总动脉分叉点)，有轻微阻力时停止，扎紧并固定栓线，缝合皮肤，2 h后抽提栓线至颈总动脉内制备再灌注损伤模型。假手术组只分离血管，不插入尼龙线。

1.2.3神经功能损伤评分参照Longa等[3]的5分法对脑缺血24 h后的大鼠进行神经功能评分。0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾悬空不能伸展对侧前爪；2分：行走向右侧转圈；3分：行走困难,并向右侧倾倒；4分：不能自发行走，伴意识障碍。神经功能缺损达 1～3分实验动物纳入实验。

1.2.4ELISA测定脑组织NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平各组大鼠于脑缺血/再灌注24 h后断头取脑，取缺血侧额顶叶皮质脑组织，匀浆，按ELISA试剂盒说明书步骤操作测定脑组织中NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达。

1.2.5Western blot检测脑组织PPARγ的表达水平大鼠于脑缺血/再灌注24 h后断头取脑，在冰上分离缺血侧额顶叶皮质脑组织100 mg加入到1 mL蛋白裂解液，匀浆，离心提取总蛋白，并测定蛋白浓度。经灌胶、上样、10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭等步骤后，分别加入兔抗大鼠PPARγ多克隆抗体(1∶500； SANTA CRUZ公司提供)、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶2000；美国SANTA CRUZ公司提供)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1∶2000)，室温孵育 2 h，再经TBST(加入吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液)洗膜，超敏增强化学发光试剂盒A液和B液反应，压片、X胶片曝光显影、图像采集。再用Image Pro-Plug 610图像分析软件测定目的条带的累积吸光度值，以β-actin为内参照，以目的条带的吸光度值与β-actin条带的吸光度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

2结果

2.1蒺藜皂苷对大鼠脑缺血神经功能损伤的影响假手术组大鼠神经功能无损伤(0分)，模型组、蒺藜皂苷低剂量组、蒺藜皂苷高剂量组神经功能损伤评分分别为(2.3±0.7)分、(1.8±0.7)分、(1.3±0.5)分，各组比较差异有统计学意义(F=17.14，P<0.05),脑缺血/再灌注24 h 后，模型组大鼠神经功能损伤评分明显高于假手术组，蒺藜皂苷高剂量组明显低于模型组(P<0.05)。

2.2蒺藜皂苷对大鼠脑组织NF-κB、TNF-α和IL-1β表达的影响脑缺血/再灌注24 h后，大鼠脑组织NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平均明显增高。与假手术组比较，模型组NF-κB、TNF-α和IL-1β水平均显著升高(P<0.05)。与模型组相比，蒺藜皂苷低剂量缺血脑组织NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平明显降低(P<0.05)。高剂量组NF-κB、TNF-α的水平明显降低，见表1。

2.3蒺藜皂苷对大鼠脑组织PPARγ蛋白表达水平的影响与假手术组相比，模型组、蒺藜皂苷低和高剂量组PPARγ蛋白水平降低(P<0.05)。与模型组相比，蒺藜皂苷低剂量和高剂量组缺血脑组织PPARγ蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。见图1。

3讨论

脑缺血后，缺血区产生具有致炎作用的细胞因子可诱导多种黏附分子的表达，并进一步促进白细胞的浸润，产生炎症反应，加重脑损伤。因此，干预缺血性脑卒中炎症反应的某些环节可能成为治疗缺血性卒中的新的有效途径，而传统中药可通过干预炎症反应的各个环节而发挥神经保护作用。

NF-κB:核因子κB;TNF-α:肿瘤坏死因子α;IL-1β:白细胞介素1β;a与假手术组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.05;c与蒺藜皂苷低剂量组比较，P<0.05

以往研究发现，NF-κB是介导炎症免疫、细胞增殖分化和诱导细胞凋亡等作用的关键性转录因子，广泛存在于真核细胞中，脑缺血损伤时可激活NF-κB的表达[4]。NF-κB活化后能调控一系列基因的表达，如炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶等，引发炎症级联反应[5-6]；而这些因子反过来又可以进一步激活NF-κB，从而使NF-κB活化在组织间不断扩散，加重炎症反应[7]。

近年研究表明，PPARγ也与缺血性脑卒中的发生、发展密切相关[8]。PPARγ是核受体超家族成员之一，其激活后可以抑制脑组织缺血/再灌注导致的 NF-κB、IL-1β、环加氧酶2、TNF-α等转录因子和炎性细胞因子基因的表达，从而减轻炎性细胞在缺血灶的炎性浸润及细胞毒性作用，提示PPARγ表达的增强与抑制脑缺血/再灌注的炎性损伤密切相关，是调节脑缺血炎症反应的重要作用靶点[9-10]。

本实验通过建立大鼠脑缺血/再灌注损伤模型，证实了蒺藜皂苷具有减轻脑缺血神经功能损伤作用，即蒺藜皂苷对大鼠脑缺血具有神经保护作用，这与以往研究相一致[1-2]。

此外，本研究结果显示，脑缺血/再灌注24 h后大鼠脑组织PPARγ表达均明显降低，NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达均明显增高，可以推断脑缺血后抑制PPARγ表达、激活NF-κB表达，而NF-κB活化后引发的一系列病理生理过程，促进了炎症的发生、发展，从而加重了脑损伤；而蒺藜皂苷各剂量组可明显增加大鼠缺血脑组织PPARγ的表达水平，且明显降低缺血脑组织NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达，提示蒺藜皂苷可能是通过增加大鼠缺血脑组织PPARγ的表达，进而抑制NF-κB炎症信号通路，减轻炎症反应，从而减轻缺血性脑损伤。

综上所述，蒺藜皂苷可能通过激活PPARγ的表达，进而抑制NF-κB炎症信号途径，抑制炎性细胞因子的表达，减轻炎症反应，从而减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤而发挥其神经保护作用。

参考文献

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Effects of Saponins of Tribulus Terrestris on PPARγ and NF-κB Signaling Pathways Expression in Rat Brain Following Cerebral Ischemic InjuryZHAIFeng-guo,LIHou-zhong,ZHOUFu-bo,LINfeng,GUANLi-xin.(DepartmentofPharmacology,MudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China)

Abstract:ObjectiveTo study and explore the effect of tribulus terrestris on the expression of peroxisome proliferators γ(PPAR γ) and nuclear factor κB (NF-κB) inflammatory signaling pathways in rat brain tissue after focal cerebral ischemia,and further explore its potential mechanisms.MethodsAccording to random number table method,40 SD rats were randomly equally divided into sham operation group,cerebral ischemia-reperfusion model group,low-dose saponins of tribulus terrestris group and high-dose saponins of tribulus terrestris group.Cerebral ischemia reperfusion model was established with suture emboli method in middle cerebral artery of rats.Neurological deficit scores was measured 24 hours after the cerebral reperfusion.Content of NF-κB,tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-1β(IL-1β) in rat brain was detected by ELISA;expression levels of PPARγ protein in rat brain was determined by Western blot.ResultsCompared with the model group,nerve function injury of low dose tribulus terrestris saponin treatment group and high dose group obviously reduced[(1.8±0.7) scores,(1.3±0.5) scores vs (2.3±0.7) scores],the difference was statistically significant(P<0.05).NF-κB,TNF-α and IL-1 β level of low dose saponins of tribulus group [(16.4±1.3) μg/mg,(257±110) pg/mg,(148±16) pg/mg]and high dose group [(15.0±1.2) μg/mg,(665±72) pg/mg,(139±14) pg/mg]were lower than those of the model group [(18.4±1.5) μg/mg,(916±128) pg/mg,(169±16) pg/mg](P<0.05).ConclusionSaponins of tribulus terrestris exerts the neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through inhibiting the inflammatory reaction,which may be associated with the increase of the PPARγ protein expression and inhibition of NF-κB inflammation signal pathway.

Key words:Cerebral ischemia-reperfusion; Saponins of tribulus terrestris; Inflammation; Nuclear factor κB; Peroxisome proliferator activated receptor γ

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-08-04编辑：伊姗

基金项目：黑龙江省自然科学基金(H201379)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551527)；黑龙江省卫生厅科研课题(2012-276)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.043

中图分类号：R966

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4539-03