精子DNA损伤对生殖结局影响的研究进展

谭　艳(综述)，范立青(审校)

(1.中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410078； 2.株洲市妇幼保健院生殖科，湖南 株洲 412000)

精子DNA损伤对生殖结局影响的研究进展

谭艳1,2△(综述)，范立青1※(审校)

(1.中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410078； 2.株洲市妇幼保健院生殖科，湖南 株洲 412000)

摘要：人类精子染色质结构的完整性是影响精子生育能力和子代安全性的重要因素，与生殖结局密切相关，可导致并预测男性不育及自然流产，亦可评估人工授精(IUI)的预后情况，并且影响体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及卵胞浆内单精子注射(ICSI)的受精率、着床率、妊娠率、活产率等。而精子DNA损伤的增加与流产的增加有关，对后代健康的不良影响也是通过DNA损伤的精子遗传的，因此，精子DNA损伤阈值的确定对改善辅助生殖的治疗结局非常重要。

关键词：精子；DNA损伤；染色质；生殖结局；阈值

不孕不育大约影响15%的育龄夫妇，其中25%～40%存在男性因素的不育[1]。在过去的100余年，男性不育的临床诊断主要依赖于MacLeod和Gold最初建立的精液分析法与评价体系[2]。然而，人类精液分析在预测男性生育能力或生育结局方面还存在明显的不足，近年来精子DNA损伤的评估在分子水平上解决了这一问题。精子DNA损伤被证实对男性不育和辅助生殖结局是有价值的生物标志物，并可诊断预后，它与降低受精率、胚胎质量、妊娠率以及较高的流产率和儿童疾病相关联[3]。精子DNA损伤是精液质量的一个重要指标，它的常规检测将改善辅助生殖技术的成功率。现就精子DNA损伤对生殖结局影响的研究进展进行综述。

1精子染色质的结构

精子染色质的结构具有双重功能，不仅在储存和运输到卵母细胞的过程中保护DNA免受损伤，而且在卵浆中能快速完整地打开未损伤的父源基因。在精子的形成过程中，DNA的包装与体细胞不同，所有的组蛋白均被过渡蛋白替代，接着被鱼精蛋白替代，鱼精蛋白作为精子染色质的主要结合蛋白，在正确包装父源DNA过程中起关键作用，其将DNA折叠成紧密封装的螺线管，每个螺线管约有50 kb DNA，当鱼精蛋白添加到DNA时，这些螺线管在体外以渐进方式形成，整个过程使染色质凝集得十分紧密，形成一个几乎无水的晶体结构，缺水对于减少DNA损伤非常重要；组织结构的任何异常变化都会导致父源DNA传递的延误或缺陷，除此之外，精子从睾丸到达卵母细胞的过程中，DNA的任何损伤均不可修复，直到进入卵浆中的DNA修复系统；精子染色质高于或低于正常的压实和稳定均会增加DNA易损性，而且一些组蛋白仍存在于完全成熟的精子端粒体、基质附着区等位置，这样的DNA更容易受毒素损伤[4]。

2精子DNA损伤的机制和影响因素

2.1损伤机制引起精子DNA损伤的机制尚不完全清楚，主要包括：①成熟精子中活性氧诱导产生DNA缺口，这是精子染色质损伤的主要原因；②失败的生精细胞凋亡；③在生精过程核蛋白组型变换时，拓扑异构酶产生的缺口修复失败[5]。

2.2影响因素

2.2.1环境毒物多种化学产品可能损伤精子的染色质。研究表明，环境中的杀虫剂和甲胺磷[6]与精子染色质完整性呈负相关，电子电器产品中的四溴双酚A会增加精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation,SDF)[7]。近期发现，手机射频电磁场[8]和无线网络连接[9]对精子的活力和DNA完整性也有影响。特殊环境及职业人群的SDF 指数(DNA fragmentation index，DFI)显著增高，如司机、高温或有毒环境工作的工人[10]。

2.2.2生理病理因素年龄是影响精子染色质完整性的重要因素，随着年龄的增加，凋亡精子和SDF的百分率均增加[11]。流行病学调查研究发现，精子DNA损伤与精索静脉曲张、支原体[12]、衣原体[13]等病因有关。日本有研究指出，慢性酗酒是SDF的重要预测变量[14]。

2.2.3医源因素化疗和放疗会显著诱导精子DNA损伤，降低鱼精蛋白水平，从而改变DNA结构；化疗结束24个月，治疗成功的睾丸癌患者仍有高浓度的精子DNA损伤[15]。

3精子DNA损伤的检测方法

精子自身没有修复机制，DNA损伤几乎存在于所有精子中，而临床上最重要的是损伤程度对于治疗结果的不利影响，任何有用的诊断或影响预后的检测，必须有一个阈值对临床情况提供足够的区分能力，而常规精液分析不符合这些标准。因此，近年来，用于检测精子DNA损伤的彗星试验[16]、精子染色质结构分析试验(sperm chromatin structure assay,SCSA)[17]、精子染色质扩散试验(sperm chromatin dispersion test,SCD)[18]和TUNEL试验(deoxynucleotidyltransfe rase-mediated dUTP nick end labeling assay)[19]被广泛开展。每个试验可能阐明的是DNA损伤的不同方面，因此可以预料到这些试验分析的结果并不等价。此外，DFI似乎已经成为所有的DNA测试的通用术语，但DFI只适用于SCSA。

3.1彗星试验彗星试验是一种单细胞凝胶电泳分析，可量化单个精子断链的DNA，其主要优势是只需要5000个精子，因此适用于评估临床使用后的小样本或只有很少精子可用的附睾和睾丸精子样本。不像其他试验主要检测组蛋白关联染色质的断链，彗星试验对于检测鱼精蛋白或组蛋白关联的染色质均能同等地广泛使用。最近，第一次用彗星试验报道了妊娠并活产夫妇的SDF显著低于体外受精(in vitro fertilization，IVF)治疗后未活产的夫妇；彗星试验高灵敏度的优势在于，几乎一半的以前无法解释的不孕夫妇，现在能用精子DNA损伤的形式进行诊断[20]。

3.2SCSASCSA测量的是单链SDF，只有两个简单的生化步骤，其技术要求远低于其他试验，但不适合较低的样本数量。SCSA的主要优势是同时测量两个重要的指标，即DFI和高DNA可染性。国际公认的自然妊娠和宫腔内人工授精(intrauterine insemination，IUI)妊娠DFI阈值为25%；当高DNA可染性>35%时无法成功妊娠[21]。有学者认为，主要检测螺线管连接子位点的SCSA比其他方法具有更好的临床意义[4]。

3.3SCDSCD只测量松懈的完整DNA和外围组蛋白，而非受损的精子DNA。SCD是一个简单而廉价的试验，无需依赖颜色或荧光强度，只需常规实验室的光学显微镜就能分析。3.4TUNEL试验TUNEL试验可检测单链和双链DNA损伤，可通过流式细胞仪或显微镜进行分析评估，也可灵活运用于少量样本分析和无专用昂贵流式细胞仪设施的小实验室。由于TUNEL试验特定分析磷酸二酯键的断链，因此常被用来确定凋亡。许多因素会影响TUNEL的临床应用，导致实验室间不能比较和解释临床阈值。最近，Aitken等[21]改善了TUNEL分析步骤，消除了测量坏死细胞(通常是高水平损伤)的误差，但有效的临床阈值尚未建立。

以上方法均对精子有损伤，检测后的精子不能用于辅助生殖。2011年，Mallidis等[22]利用拉曼光谱仪采集UVB波段幅照前后精子拉曼光谱的变化，结合主成分分析和小波分析，提示拉曼光谱可精确评估精子DNA结构以及损伤部位。2013年，黄祖芳[23]首次实现了活体精子头部吸附于光滑金属基底的操作，并初步开展了活体精子的显微拉曼光谱测量，初步证实1055/1095 cm-1的谱峰比值可作为评估精子质量的阈值。

4精子DNA损伤对生殖结局的影响

4.1精子DNA损伤与男性不育研究发现，精子DNA损伤>20%，自然受孕的概率开始下降，当损伤超过40%，自然受孕概率接近于零[3]。虽然精子DNA损伤<20%不能保证男性正常生育，但是DNA的高度损伤会严重影响男性的生育能力，当精子浓度<20×109/L或精子活力、形态任一项指标有损伤时，DNA损伤阈值降至10%[24]。在另一项研究中，Simon等[25]采用彗星试验发现，98%的不育男性SDF>25%。因此，有学者回顾分析了精子DNA损伤与男性不育的相关检测，初步确定了各种试验方法的检测阈值，TUNEL、SCSA、SCD、碱性彗星试验和中性彗星试验的检测阈值分别为20.05%、18.90%、22.75%、45.37%和34.37%[26]。

4.2精子DNA损伤与自然流产父源DNA构成胚胎基因组成分的一半，因此精子的一些异常因素会影响胚胎发育，从而引起流产。Imam等[27]用SCSA研究DNA损伤特发性复发性流产患者的DFI，其均值为23.37±9.9，比正常对照者(13.89±5.40)显著增高；Khadem等[28]也发现，复发性流产男性的DFI更高，精子前向运动能力更差。采用SCD分析结果也一致，精子的大晕、小晕和无晕等DNA损伤指标均有明显差异[29]。精子DNA损伤的检查应该推荐给复发性流产患者，更为重要的是建立判断预后的检测阈值。Ribas-Maynou等[30]提出，当中性彗星试验SDF>77.5%，根据卵母细胞修复双链DNA损伤的能力，可预测流产的可能性，此方法的灵敏度和特异度分别为88.3%和88.0%；同时提出SCD的阈值为18.5%，但灵敏度低于中性彗星试验。

4.3精子DNA损伤与辅助生殖技术

4.3.1精子DNA损伤与IUI精子DNA损伤和低生育力之间的关系在IUI表现明显。杨晓玉等[31]分析了482例IUI患者，发现DFI>25%的患者，其生化妊娠率和临床妊娠率只有DFI≤25%的患者的0.37倍和0.38倍。Bungum等[32]对131对夫妇进行IUI治疗，结果显示，DFI≤27%的患者比 DFI>27%的患者怀孕和分娩的机会更高，建议所有IUI患者检测精子染色质完整性，以较好地评估预后。Baldi和Muratori[4]总结后认为，彗星试验<25%、SCSA<15%时才选择IUI治疗。经过IUI精子处理程序后，复发性流产患者也能提高妊娠率。张洲等[33]尝试对33例复发性流产患者进行IUI治疗共79个周期，妊娠率为17.7%，高于同期IUI妊娠率(12.4%)，而流产率(7.1%)显著低于文献报道的复发性流产的流产率(30%～40%)。

4.3.2精子DNA损伤与体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)/卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)IVF-ET和ICSI技术使男性不育患者可获得其生物学子代的机会，但是这些技术尤其是ICSI技术使一些DNA损伤精子也会被注入卵母细胞内。卵母细胞虽有修复精子DNA损伤的功能，但这种修复机制只有在精子DNA损伤<8%时才有效，超过这个水平可能导致卵母细胞激活障碍和胚胎发育受到损害[34]。Simon等[35]分析研究了215对采用辅助生殖技术的夫妇，认为SDF的增加对胚胎质量会产生不利影响，包括降低受精率，降低胚胎卵裂率和质量，减少发育成囊胚的胚胎数量，胚胎停育的数量增加，并且会降低着床率和妊娠率，且这种影响从早期胚胎发育的第2日开始并持续至胚胎移植之后，从而降低了植入率和妊娠结局。Zhao等[36]证实，无论IVF还是ICSI，高精子DNA损伤均会导致更高的流产率。使用彗星试验的最新研究表明，当SDF较低(<25%)时，IVF治疗后有33%的活产率，但当SDF>50%时，IVF的活产率仅为13%[20]。有学者统计发现，当DFI≤17.6%时，怀孕概率增高3.5倍，DFI每增加10%，不孕概率增加1.31%[34]。若对ICSI技术进行改进，如胞质内精子形态学选择注射，可减少注射DNA受损的风险，似乎能改善临床结局，尤其是对精子DNA损伤起关键作用的老年妇女的ICSI周期[37]。然而,有数据对初步得到的有利结果存在质疑。在一个前瞻性临床研究中，ICSI和IVF患者妊娠后均无SCSA的参数差异，即使存在高水平的DFI[38]。Niu等[39]也指出，在223对IVF夫妇中，不同DFI组，除优质胚胎率外，临床妊娠率没有显著差异。对1082个卵裂期冻融胚胎周期和653个囊胚期冻融胚胎周期研究后发现，ICSI周期中SDF≤30%组的囊胚形成率明显增加，但SDF10%、20%、25%、30%、35%、40%组的临床妊娠率、生化妊娠率和流产率均无明显变化[40]。

事实上，不管应用哪种技术，高水平的精子DNA损伤都与妊娠丢失风险的增加相关(OR=2.5,95%CI1.5～4.0)[41]，因此，选择没有DNA损伤的精子可以改善辅助生殖技术的治疗结果，精子DNA损伤阈值的确定对于临床更有意义。Baldi和Muratori[4]回顾总结了前人的研究后认为，IVF周期中彗星试验和SCSA的阈值分别为25%～50%和15%～30%；当彗星试验或SCSA>50%时，建议进入ICSI周期治疗。

4.4精子DNA损伤影响后代健康动物研究提供了令人信服的证据，表明诱导男性生殖细胞系的DNA损伤可引起流产和后代的发病率[42]。研究表明，对后代健康的不良影响是通过DNA损伤的精子遗传的，癫痫的高发生率、精神分裂症、自闭症和双相情感障碍等疾病的高发生率与之相关，后代癌症以及先天性畸形的风险增加也与之相关；父亲的年龄与精子DNA损伤的发生率高相关，使后代增加突变负荷[11]。以往IVF和ICSI未发现风险存在差异，但最近澳大利亚南部的研究分析显示，ICSI比IVF婴儿出生缺陷显著增加[43]，但这种差别在冷冻胚胎中并未发现。胚胎冷冻相关的压力可能会选择性消除任何有缺陷的胚胎生成。根据这些结果，在父亲精子高DNA损伤以及存在明显的正常胚胎发育风险的情况下，似乎可选择ICSI胚胎常规冷冻。

5小结

精子DNA损伤的评估非常重要，应作为精液常规检查的一部分，并可作为预测辅助生殖治疗成功的有用指标。精子SDF并非静态参数，其与SDF动力学的关系需要进一步探讨。由于高精子DNA损伤的IUI成功率非常低，建议患者直接进入IVF或ICSI周期。在辅助生殖之前，适当口服抗氧化剂组合来改善精子DNA损伤情况应该是合适的，在分子水平上建立精子DNA损伤的潜在的抗氧化治疗方法是迫切需要解决的问题。

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The Research Progress of Sperm DNA Damage Effect on Reproductive OutcomesTANYan1,2,FANLi-qing1.(1.InstituteofHumanReproductionandStemCellEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China； 2.DepartmentofReproduction,ZhuzhouCityMaternalandChildHealthCareHospital,Zhuzhou412000,China)

Abstract：The integrity of human sperm chromatin structure is an important factor affecting sperm fertility and child safety,thus is closely related to the reproductive outcomes:and it can cause and predict male infertility and spontaneous abortion;and it can be used to evaluate the prognosis of intrauterine insemination(IUI),and affect the in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET) and intracytoplasmic sperm injection(ICSI) fertilization rate.implantation rate and pregnancy rate,etc.The increase of sperm DNA damage is associated with abortion increases.Adverse health effects to offspring is through genetic DNA damage of sperm,so the determination of sperm DNA damage threshold is very important for improving outcome of assisted reproduction treatment.

Key words：Sperm； DNA damage； Chromatin； Reproductive outcomes； Threshold

收稿日期：2015-03-10修回日期：2015-05-16编辑：郑雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.011

中图分类号：R698

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4448-04