循环微小RNA的研究进展

尤冬梅

天津市蓟县人民医院检验科　301900

循环微小RNA的研究进展

尤冬梅

天津市蓟县人民医院检验科301900

摘要微小RNA(microRNA,miR)在体液中可稳定存在，其表达谱和表达量的变化与肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病等多种疾病相关，可以作为疾病诊断、病理分型、预后判断以及个体化治疗的生物标志分子。miR的检测手段和检验流程还需要标准化，以保证检测结果的重复性，达到较好的检验灵敏度、特异度和重复性。已有部分miR表达谱被证实可以作为各种恶性疾病诊断和预后评估的生物标志物，有望应用于常规临床疾病诊断。

关键词微小RNA

microRNAs(miRNAs)是一类非编码的内源性小RNA,在细胞生长发育、分化、凋亡过程中发挥重要的作用。研究发现miRNAs可从细胞内释放,广泛而稳定地存在于细胞外液,统称为循环miRNAs。miR自身表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。研究表明，miR几乎参与了所有生命活动，包括细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡和细胞增殖。miR既可作为抑癌基因下调原癌基因活性也可作为癌基因下调抑癌基因活性，还可调节肿瘤相关基因的表达，其自身突变、缺失、易位及相互调控异常等还可导致相关基因异常表达[1]。自被发现以来，miR一直是近20年，尤其是近5年来生命科学和医学界的明星分子[2]。本文对miR的特点及作为疾病诊断标志物的研究应用现状综述如下。

1miR的特点与功能

miR具有调控细胞周期、分化细胞等基本功能，并参与多种疾病的发生和发展[3]。计算机预测表明，超过60%的人类蛋白编码基因至少受1个miR的调控[4]。miR与靶mRNA序列完全或几乎完全配对时，引起靶mRNA降解；而不完全配对时，则抑制靶基因翻译[5]。除了上述作用模式，后续研究表明，miR也可以和靶mRNA的任何互补序列结合，并发挥其调控作用。除了抑制靶mRNA的功能，miR也能作用于启动子诱导转录激活，甚至随着细胞周期的改变，miR的功能可以在抑制转录和激活转录间进行切换[6]。miR表达(谱)发生改变通常与各种疾病的发生发展密切相关。miR不同的表达谱，甚至是单个miR的改变都可能成为辅助疾病早期诊断、分类、预后和预测的指标。尽管目前报道的miR大部分源自于细胞内的研究，研究者们在各种体液中也发现越来越多的细胞外miR[7]。研究证实血清和血浆miR稳定性较高，在4℃保存、室温保存、反复冻融、长期存储，甚至是煮沸或酸碱处理情况下都可以保持稳定[8]。目前认为体液中miR常与蛋白质等构成复合物存在，因此具有良好的抗RNA酶降解能力，能稳定地发挥生物学作用[9]。miR可在血清和血浆等体液中稳定存在，使得筛选循环miR作为疾病的新一代无创性实验室诊断标志物成为可能。

2筛选具有疾病诊断价值的miR的主要方法

由于miR在病理组织中常发生差异表达，并在疾病的发生发展过程中发挥一定的作用。因此，发现表达失调的miR是提出新的疾病诊断标志物的主要思路。目前高通量筛选差异表达miR的方法主要为miR芯片(miRNA microarray)和MPSS(Massive parallel signature sequencing)两种，两者各有优势。miR芯片主要针对已知序列的miR基因进行表达检测，其可以较为敏感、精确地检测已知miR的表达差异。MPSS主要用于miR组的主要成分以及其中富集表达的miR，及其在不同组织中的表达差异。通过检测患者体液标本中miR亦可实现疾病诊断的目的，而发现体液标本中的miR通常只能通过MPSS检测以获得其序列以及拷贝数，随后通过定量逆转录聚合酶链反应等低通量方法加以验证，这是目前发现体液中的miR以及明确其作为疾病诊断分子靶标价值的主要思路和技术手段。

3循环miR在疾病诊治中的临床应用

miR在疾病的发生发展过程中发挥了重要作用，可以作为疾病诊断、病理分型、预后判断以及个体化治疗的生物标志分子，也是多种疾病基因治疗的潜在靶点[10]。miR还可用于多种肿瘤预后的判断以及药物治疗、放疗和化疗效果的预测[11]。

3.1肿瘤miR作为肿瘤标志物用于临床疾病的无创诊断预警在国内外均备受关注。许多人类miR定位于基因组肿瘤相关区域或脆性位点，控制着细胞增殖、黏附、凋亡、血管形成等重要生物进程。研究表明，多种肿瘤患者体内均存在循环miR的异常变化，特异性循环miR表达变化可以提供多种疾病相关信息。如：早期诊断恶性肿瘤；区别原发瘤和转移瘤，辅助选择合适治疗方案[12]；用于肿瘤的病理分期；用于肿瘤病理分型(miR-205)在鳞癌中高表达，在辅助非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌分型中具有很高的敏感度、特异性和重复性[13]。李雪峰等建立了一种SYBR Green I荧光定量PCR检测血清miR-21的方法，探讨其对乳腺癌诊断的应用价值[14]，为开展肿瘤血清中miR-21诊断与预后研究提供了技术平台。理想的循环miR标志物在肿瘤患者外周血中呈中等或高水平表达，在健康人血浆中检测不到或低水平存在[15]。

3.2心脑血管疾病miR参与多种心血管系统早期病理改变，缺血性心肌病、扩张性心肌病、心力衰竭以及主动脉狭窄患者中均存在miR的差异表达。AMI急性期有多种心脏特异性miR表达异常，其中检测miR-208a在血浆中升高的敏感度与心肌肌钙蛋白I(cTnI)相当，而miR-1的血浆水平与AMI的严重程度以及致死性心律失常密切相关，是反映疾病进展和治疗效果的新的血液标志物。血浆miR-423-5p是慢性充血性心力衰竭患者较好的预测指标[16]。

3.3免疫性疾病miR与机体的免疫功能存在着重要的联系，miR通过影响免疫细胞的发育、细胞亚群的分化及功能，参与机体固有免疫与获得性免疫活动，在免疫系统中发挥着重要调控作用，并与自身免疫性疾病的病理、生理密切相关。近年来研究人员在许多自身免疫性疾病中都找到异常表达的miR。Keller等[17]先研究miR在MS中的诊断效能，发现单个miR-145在所有异常表达的miR中具有最好的效能。多发性硬化症患者PBMC中miR-18b、miR-599表达异常改变可能与疾病复发密切相关，而miR-96则可能在疾病缓解中发挥功能作用[18]，循环miR是对自身免疫性疾病诊断、预后判断、疾病活动度和严重程度评估都很有希望的非侵袭性候选标志物。

3.4其他疾病miR是代谢活跃组织发育和维持的重要调节因子，miR的表达改变将导致糖和脂质代谢稳态受损。多个不同研究均发现妊娠妇女血浆中存在特异的miR，提示miR可能作为妊娠周期以及妊娠相关疾病的诊断标志物。miR-526、miR-527能够准确诊断妊娠。血浆miR-122表达升高对于病毒、酒精以及化学物质引起的肝损伤诊断价值较高，具有很好的敏感度和特异度。张霞等建立了SYBR Green I FQ-PCR检测人外周血单个核细胞中miR-202表达的方法，发现miR-202在多发性骨髓瘤(MM)患者中表达普遍上调，与健康对照组相比差异有统计学意义，说明miR-202与MM的发生和发展关系密切。

4miR的检测方法及影响因素

循环miR的检测方法主要包括：RNA印记分析法(Northern blot)、芯片方法、荧光定量PCR、液相单分子检测、高通量测序、电化学检测、生物发光检测等。每种方法都不是很完美，都存在一定的内缺陷，需要根据特定的实验环境选择最合适的检测方法。现有的大量研究结果采用了多种不同的研究平台和定量方法。近期，国内多个实验室在这方面进行了有效的探索，加快了循环miR检测走向临床的步伐。陈必成等建立了改良通用茎环引物法结合荧光定量PCR对miR进行筛选和定量检测技术。与传统茎环引物RT-PCR检测相比，该方法快速、稳定、灵敏、省时、经济，提高了miR的筛选效率。

近年来，已有很多研究证明miR在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要作用，因此，通过检测miR的表达进而实现疾病的诊断、病理分型和预后判断，以及作为疾病基因治疗的潜在靶点，将展示出广阔的临床应用前景。miR可能成为疾病诊断新的生物学标志，还可能使其成为药靶，或是模拟这一分子进行新药开发，这将可能给人类疾病的治疗提供一种新手段。相信随着研究的不断深入，miR检测和研究将会为疾病诊断及预后判断带来新的发展。

参考文献

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(编辑杨阳)

◎致作者◎

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收稿日期2014-11-18

中图分类号：R446.9

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)13-1722-03