氟乙酰胺药物检测方法的研究



氟乙酰胺药物检测方法的研究

陈涛1，高庆刚2

(1.延安市公安局，陕西延安716000；2.榆林市公安局，陕西榆林719000)

氟乙酰胺杀鼠药又名敌蚜胺、毒头王、灭三辈，其毒性大、二次中毒严重，为国家禁用的剧毒药物，现时一些地方仍在非法使用，给人民生命财产造成很大危害，对氧乙酢酰胺药物的检测就显得尤为重要。

1氟乙酰胺的基本特性

1.1物理特性

白色针状结晶，无味，微碱性，易溶于水、甲醇、乙醇等，微溶于二氯甲烷、氯仿，难溶于石油醚。

1.2代谢机理

此类药物进入生物体内迅速代谢为氟乙酸，此物质为小分子，且极性大，易溶于水，与三磷酸腺苷和辅酶A作用而形成氟乙酸辅酶A，然后与柠檬酸作用形成氟柠檬酸，从而抑制乌头酸酶，使三羧酸循环受阻，进而损害神经系统，导致一系列的病变。其性质稳定，毒性强，致死量(人)约为50～100 mg。

1.3检材提取

由于氟乙酰胺在体内易转化为氟乙酸，检材物以呕吐物、剩余食物、胃内容物为最佳，其次选择血、肝、肾、尿。在死亡较快且检验及时的情况下，可从胃内容物、胃组织、血、肾组织检出氟乙酰胺，而其它检材如心、肠组织、尿则不易检出，但可检出其代谢产物氟乙酸。氟乙酰胺一般用水浸泡提取，或配比一定比例的强极性有机溶剂提取，常见有乙腈/水、丙酮/水、甲醇/水。有时也用弱极性有机溶剂(如乙酸乙酯)提取，此法可以减少杂质干扰，从中加入食盐至饱和可提高萃取效率。

2检验方法

2.1化学法

硫靛反应法是分析氟乙酰胺药物最为普遍的化学方法[1]，此方法反应条件较易掌握，且操作简单，其原理主要是根据对最终反应产物硫靛的颜色变化来进行定性。用甲醇：水(7：3)做提取剂浸泡血、尿等生物检材，离心10 min，取上清液，加入硫代水杨酸后用NaOH溶液调碱性，加热，放置冷却，再加铁氰化钾，加氯仿，溶液若显洋红色为阳性，否则，为阴性。实验表明，此反应在适当条件下灵敏度高，干扰少，也是检验氟乙酰胺比较理想的化学反应。缺点是有时出现假阳性，可采用气质联用仪和紫外可见分光光度计检测，实验结果灵敏度达到20μg，此法从而解决了硫靛法检验氟乙酰胺准确性不强的问题。总的来说，从基层至地方毒检单位，此法仍是检验氟乙酰胺较为理想的方法之一。

2.2色谱法

2.2.1薄层色谱法用TLC(薄层色谱)法对氟乙酰胺进行检测，得到最小检出限0.1μg的好效果。将硫靛反应的氯仿层浓缩，然后在硅胶G板上进行层析，由于其产物本身为洋红色，所以不需显色剂，用乙酸乙酯：丙酮=4∶1或氯仿：乙醇=5∶1作展开剂，得到检出限为1～2μg。采用萘氏试剂作为显色剂，氟乙酰胺显黄至红褐色，采用乙酸乙酯：丙酮=60∶40作展开剂，得到最低检出限为10μg，这些实验结果显示薄层色谱灵敏度不高。[2]

2.2.2气相色谱法气相色谱法(GC)是目前使用较多的方法。GC/NPD原理是氟乙酰胺在酸性条件下以N，N’-二环乙基-碳酰亚胺(DDC)作催化剂与芳香胺进行衍生化反应，再用乙酸乙酯作萃取剂进行提取，然后使用GC/NPD检测。此方法的最低检测限为0.2μg/ml；关于GC/FID，用此法对于新鲜脏器可不需衍生化直接进行检测，且空白脏器无干扰。此方法的最低检测限为0.5μg/ml。但是FID检测器属通用型，一般CH的物质均可检出，因此检测专属性不强；关于GC/ECD，用五氟卞基溴(PFBBr)作衍生化试剂对氟乙酸进行衍生化，生成乙酸五氟卞基酯(FAC-PFB酯)，然后用GC/ECD进行分析[3-4]。此方法用PFBBr衍生化，血液中最小检测限可达2.0 ng/ml，灵敏度最高。但在生物脏器中还含有一定量的各种有机酸物质，能与PFBBr反应形成衍生物，因此会出现大量杂质峰，从而影响到检测器和色谱柱。

2.2.3气相色谱质谱联用法(GC/MS)对呕吐物、胃内容、血、肝或吃剩食物等检材，通过水解，使氟乙酰胺转化成氟乙酸后，以乙酸乙酯为提取剂，用PFBBr作为衍生化试剂对氟乙酸进行衍生化，使氟乙酸衍生为乙酸五氟卞基酯(FAC-PFB酯)[5]，然后通过GC/MS分析。实验结果显示，测得的FAC-PFB酯分子结构稳定，分子量为258。此质谱图上有4个主要特征碎片离子：m/z177，178，181，258。其中基峰为m/z181，而m/z181，178处无杂质峰干扰，这样使得定性比较容易，可靠性大大提高。

2.2.4液相色谱法氟乙酰胺的液相色谱法可分为液相色谱荧光(HPLC/FLD)和液相色谱紫外(HPLC/UVD)法。因氟乙酰胺本身对紫外是没有吸收的，所以先要通过衍生化使其转变成含有紫外基团的衍生物才能进行检测。4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(BrMMC)是HPLC理想衍生化试剂，其具有荧光活性。首先用乙腈对检材血样沉淀蛋白，再依次加入衍生化试剂BrMMC和催化剂四丁基溴化铵，在水浴(75℃)中进行衍生化反应，衍生物用HPLC/UVD和HPLC/FLD分别进行检测。测得最低检出限：紫外为0.10 μg/ml；荧光为0.05 μg/ml。最佳色谱条件：乙腈：水=40∶60；FID检测激发波长为319 nm，发射波长为390 nm，UVD检测波长为319 nm。荧光检测法和紫外检测法分别在0.16-15.30 μg/m和l0.30-38.40 μg/ml范围内具有良好的线性关系。可得出HPLC/UVD和HPLC/FLD法具有很好的准确性、灵敏度和精密度[6-7]。因荧光检测器在高灵敏度和高选择性上都优于紫外检测器，所以选择液相色谱荧光检测器能使分析效果达到更好。

2.2.5液相色谱质谱联用法(LC/MS)液相色谱质谱联用法(LC/MS)常用的离子化方式是电喷雾离子化(ESI)检测模式，对检材血在该模式下实验，检测得到定性和定量离子峰为m/z77，最低检测限为2.0 ng/ml。选择对检材血采用大气压化学电离(APCI)方式，SRM正离子模式方式检测，氟乙酰胺母离子78，子离子61。此法测得氟乙酰胺最低检测限为10 μg/ml，且在10～500 μg/ml具有良好的响应。因ESI效率较APCI低，且氟乙酸类药物热稳定性较好，所以通常采用APCI。若选择ESI，需结合已经使用的衍生化方式先进行柱前衍生化，而后再进行液质检测，则可以提高ESI效率[8]。

3小结

综上所述，对氟乙酰胺药物的检测中GC/ECD法是灵敏度最高且使用最广泛的方法之一。但是由于生物检材中含有较多的内源性杂质，从而对单一用气相检测的准确性产生一定影响。而薄层色谱法灵敏度差是其缺点。硫靛反应法虽方法简便易掌握，但易出现假阳性，结合气质联用仪和紫外分光光度计则使方法复杂化了。利用GC/MS或LC/MS联用检测生物体内微量的氟乙酸类物质可以解决有假阳性出现的问题，且此法具有很高的灵敏度和精密度，对检验结果起到确证，使得定性、定量更加容易。总之，有关氟乙酰胺的测定，需要根据相关检材以及本部门仪器设备等实际情况，制定出若干种便于操作及准确性好的方来操作，要尽可能地减少失误，为决策层提供可靠和正确的依据。随着现代化技术的不断进步，今后将会有更加简便易行的检测方法得以推广和应用，而GC/MS或LC/MS法将成为今后检测氟乙酰胺药物较为理想的方法。

参考文献

[1]王群，江勇，丁国兴，等.硫靛反应检验氟乙酰氨的方法改进[J].刑事技术，2010(2)：44-46.

[2]金良正.毒鼠强与氟乙酰胺的快速薄层鉴别[J].中国公共卫生，2003，19(3)：364.

[3]宣宇，曹荣，傅得锋，等.氟乙酰胺类杀鼠药检测方法的研究进展[J].刑事技术，2012(1)：49-51.

[4]封世珍，于忠山.GC/NPD、GC/FID、分析生物样品中的氟乙酰氨[J].法医学杂志，1999，15(2)：91-92.

[5]李峰，洪萍，楼冰冰，等.GC/MS快速检测中毒样品中氟乙酰氨[J].中国卫生检验杂志，2009(2)：309-310.

[6]谢珍茗，施文兵，刘岚，等.荧光试剂衍生化液相色谱分析生物检材中的氟乙酸钠[J].中山大学学报(自然科学版)，2007，46(3)：64-67.

[7]陈学国，朱昱，姚伟宣，等.HPLC-UVD/FLD法测定血中氟乙酸类杀鼠剂[J].中国法医学杂志，2012，27(3)：230-232.

[8]黄思成，舒鹏，李岩.利用LC/MS法检验氟乙酸钠分析[J].科技创新导报，2012(28)：153-154.

[收稿日期2015-06-12；责任编辑徐文梅]

作者简介：陈涛(1987—)，男，陕西府谷人，双学士学位，助理工程师。