PARP抑制剂对糖尿病大鼠皮层神经元的保护作用

吴晓黎，王智敏，梁鹤缤，郝颖，郑东明，郭阳

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110021）

·论著·

PARP抑制剂对糖尿病大鼠皮层神经元的保护作用

吴晓黎，王智敏，梁鹤缤，郝颖，郑东明，郭阳

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110021）

目的研究PARP抑制剂3-氨基苯甲酰（3-AB）对链脲佐菌素诱导的糖尿病（DM）大鼠皮层神经元的作用及机制。方法将60只大鼠随机分假手术对照组、DM组和DM+3-AB组，每组20只。采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，采用紫外分光光度计法测定皮层组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量，采用Western blot法检测皮层PARP1蛋白表达水平，采用免疫组化法检测皮层caspase-3表达变化。结果DM组大鼠学习记忆能力明显下降。DM组的SOD和GSH-Px含量显著低于对照组（P＜0.01），MDA含量显著高于对照组（P＜0.01），DM+3-AB组的SOD和GSH-Px含量明显高于DM组（P＜0.05），MDA含量明显低于DM组（P＜0.05）。DM组的PARP1表达显著增加（P＜0.01），DM+ 3-AB组的PARP1表达显著降低（P＜0.01）。DM组的caspase-3表达显著高于对照组（P＜0.01），DM+3-AB组的caspase-3表达显著降低（P＜0.01）。结论3-AB通过抑制PARP1，减轻DM导致的氧化应激，减少皮层神经元凋亡。

糖尿病；PARP；认知障碍；氧化应激

随着人们生活方式的改变和人口老龄化，糖尿病（diabetes mellitus，DM）发病率呈逐年上升趋势。DM并发中枢神经系统损害已经引起了人们的广泛关注［1，2］。早在1922年Miles等［3］就报道了DM相关认知障碍。Bestetti等［4，5］发现链脲佐菌素诱导的DM大鼠中枢神经系统内有显著的结构变化。Jakobsen等［6］发现链脲佐菌素诱导的DM大鼠有大量皮层神经元缺失。Li等［7］认为神经元凋亡与大鼠认知有关，2个月自发DM的BB/Wor大鼠无神经元凋亡，也不伴有认知障碍，而8个月的BB/Wor大鼠神经元凋亡增加，认知功能受损。DM导致神经元损伤的机制尚不明确，高血糖会导致活性氧簇（reactive oxy-gen species，ROS）过量产生，使多个组织发生氧化应激。最近有研究表明，氧化应激最终有可能是通过激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase1，PARP1］而发挥作用［8］。

PARP是一种富含核染色质的多功能酶，分子量为113～116 kDa，它的作用是识别DNA的缺口后结合到DNA的受损处。在生理状态下PARP的活性很低，当细胞处于氧化应激状态时被过度活化，会耗竭细胞内能量，激活细胞死亡相关蛋白，最终导致细胞死亡［9］。PARP1是否参与DM大鼠皮层神经元凋亡鲜有报道。本研究中我们应用链脲佐菌素介导的DM大鼠模型，观察PARP抑制剂3-氨基苯甲酰（3-aminobenzamide，3-AB）对DM大鼠皮层神经元的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

链脲佐菌素和3-AB（美国Sigma-Aldrich公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）（南京建成生物工程研究所）；PARP1多克隆抗体试剂盒、鼠抗caspase-3抗体、小鼠抗大鼠β-actin抗体、PARP1单克降抗体（美国Santa Cruz公司）；SABC试剂盒、DAB显色剂、SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂（北京中山公司）。

1.2 实验动物与方法

清洁级3月龄雄性SD大鼠60只，体质量200～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠随机分为假手术对照组、DM组和DM+3-AB组，每组20只。DM大鼠模型制备前大鼠禁食12 h，给予单次腹腔注射溶解于pH 4.0～4.2、浓度为0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液中的链脲佐菌素，剂量为55 mg/kg。对照组注入相同剂量的生理盐水。注射后所有大鼠放入代谢笼内常规饲养，自由饮食。大鼠血糖持续超过16.7 mmol/L、尿糖试纸（+++）的大鼠为DM大鼠。DM+3-AB组给予腹腔注射3-AB（20 mg·kg-1·d-1），持续3个月，对照组和DM组给予腹腔注射等量生理盐水。3个月后取材。

1.3 认知功能测定

采用Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力。

1.3.1 定位航行实验：选择1个象限的固定位置将大鼠面向池壁放入水中，通过自动图像拍摄系统记录游泳轨迹，记录大鼠入水至找到平台的时间，即逃避潜伏期。120 s找不到平台，潜伏期记录为120 s。其总行程为游泳距离。实验2次/d，历时4 d，第5天测试。

1.3.2 空间探索实验：训练完毕次日进行空间探索实验，撤除平台，记录大鼠120 s内穿过原平台的次数，反映空间记忆能力。

1.4 皮层组织SOD、GSH-Px和MDA含量测定

每组各取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后取脑，分离出大脑皮质，-80℃保存。SOD活力、MDA含量的测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，严格按照说明书操作，用紫外分光光度计法测定。

1.5 Western blot法检测各组脑组织PARP1蛋白表达水平的变化

每组各取5只大鼠，颈椎脱臼处死、断头、剥离并取出大脑皮质，称取各组标本100 g，剪碎加入冰预冷的细胞裂解液500 μL，超声粉碎。4℃、12 000 r/min离心0.5 h，取上清。采用酚试剂法测定蛋白浓度。进行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳，转印，用含5%去脂奶粉的TTBS封闭4℃1 h。一抗（1∶500）4℃过夜。洗膜，并加入碱性磷酸酶标记的二抗（1∶1 000），室温下2 h。TTBS清洗2次，每次5 min；TBS洗1次，5 min。酶显法显色。使用ChemiImager 5500 V3.0软件进行图像灰度扫描，Fluor Chem 2.0分析软件进行分析，获取目的条带和内参照GADPH的整合光密度值，以两者的比值作为蛋白表达半定量指标。

1.6 免疫组化法检测caspase-3表达变化

每组各取5只大鼠麻醉，开胸，用生理盐水灌流后4%多聚甲醛灌注固定。取脑置于上述固定液中固定24 h，再将标本置于30%蔗糖中沉淀24 h。组织块在恒冷切片机上切片。免疫组化操作步骤按照说明书进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠学习记忆能力

DM组大鼠逃避潜伏期和空间探索时间较对照组显著延长（P＜0.01），学习记忆能力明显受损。DM+3-AB组大鼠逃避潜伏期和空间探索时间显著缩短（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期和空间探索时间的比较Tab.1 The escape latency and spatial probe test by Morris water maze test

2.2 各组大鼠皮质SOD、GSH-Px和MDA的含量

DM组的SOD和GSH-Px含量显著低于对照组（P＜0.01）；DM+3-AB组的SOD和GSH-Px含量明显低于对照组（P＜0.05），明显高于DM组（P＜0.05）。DM组的MDA含量显著高于对照组（P＜0.01）；DM+ 3-AB组的MDA含量明显高于对照组（P＜0.05），明显低于DM组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组脑组织中SOD、GSH-Px、MDA、PARP1和caspase-3含量的变化Tab.2 Changes in expression of SOD，GSH-Px，MDA，PARP1 and caspase-3 in brain tissues in each group

2.3 各组大鼠PARP1蛋白的表达

与对照组相比，DM组的PARP1的表达水平明显升高（P＜0.01）。与DM组相比，DM+3-AB组的PARP1的表达水平明显降低（P＜0.01），见图2、表2。

图2 各组大鼠皮层中PARP1的表达Fig.2 Expression of PARP1 in cortex in each group

2.4 各组大鼠皮层中caspase-3的表达

与对照组相比，DM组的caspase-3的表达水平明显升高（P＜0.01）。与DM组相比，DM+3-AB组的caspase-3的表达水平明显降低（P＜0.01），见图3、表2。

3 讨论

大量研究已发现DM相关的认知障碍问题，而且研究还发现DM患者存在一系列神经心理学改变。对于1型DM患者，最常见的是学习能力、记忆力、解决问题能力等功能受损［10］。已有报道在1型DM患者大脑皮层可见弥漫性或局灶性的退化性变，如神经元的丢失、脱髓鞘、神经胶质增生等［11，12］。影像学也证实了脑沟增宽、侧脑室扩大、脑白质疏松等变化［13］。

图3 各组大鼠皮层中caspase-3的表达 ×200Fig.3 Expression of caspase-3 in cortex in each group×200

尽管DM导致神经元变性死亡的发病机制尚不明确，氧化应激是重要机制。机体存在两类抗氧化系统，一类是非酶抗氧化系统，包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽等；一类是酶抗氧化系统，包括SOD、过氧化氢酶、GSH-Px等。人体内氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态。DM时升高的血糖导致线粒体产生大量ROS，ROS是一种强氧化剂，过量的ROS使氧化系统与抗氧化系统失衡，导致氧化应激。ROS能够触发DNA断裂，轻微的DNA损害激活PARP-1，这有利于DNA的修复及细胞的存活。但DM诱导的氧化应激使PARP过度活化，从而耗竭ATP，导致细胞功能异常，直至死亡［14］。研究已经证实，PARP抑制剂能在氧化应激的细胞中抑制或灭活PARP并能保存细胞中的NAD+及ATP。在这种情况下，细胞能保持正常的形态，保护细胞避免坏死。

本研究通过链脲佐菌素单次腹腔注射建立DM模型，结果显示：DM组的SOD和GSH-Px含量显著降低，MDA和PARP1的含量显著增加，表明DM大鼠脑内氧化应激反应明显增强，PARP1被激活。免疫组化显示皮层内caspase-3的表达增强，表明DM诱导皮层神经元的死亡增多。给予3-AB后PARP1明显减少，SOD和GSH-Px含量显著升高，而MDA含量降低，说明3-AB抑制PARP1的活性，明显抑制氧化应激反应。DM+3-AB组皮层内caspase-3的表达减少，表明3-AB减少DM诱导的神经元凋亡，保护皮层神经元。

综上所述，氧化应激和PARP-1的活化在DM皮层神经元损伤中发挥重要作用。PARP-1抑制剂通过抑制PARP的活性，减轻细胞的氧化应激损伤，保护皮层神经元，延缓病变的发展，可能是治疗DM新的途径。

［1］Biessels GJ，Kappelle AC，Bravenboer B，et al.Cerebral function in diabetes mellitus［J］.Diabetologia，1994，37（7）：643-650.

［2］McCall AL.The impact of diabetes on the CNS［J］.Diabetes，1992，41（5）：557-570.

［3］Miles WR，Root HF.Psychologic tests applied to diabetic patients［J］.Arch Int Med，1922，30（6）：767-777.

［4］Bestetti G，Rossi GL.Hypothalamic lesions in rats with long-term streptozotocin-induced diabetes mellitus.A semiquantitative lightand electron-microscopic study［J］.Acta Neuropathol，1980，52（2）：119-127.

［5］Bestetti G，Rossi GL.Hypothalamic changes in diabetic Chinese hamsters.A semiquantitative，light and electron microscopic study［J］.Lab Invest，1982，47（6）：516-522.

［6］Jakobsen J，Sidenius P，Gundersen HJ，et al.Quantitative changes of cerebral neocortical structure in insulintreated long-term streptozocin-induced diabetes in rats［J］.Diabetes，1987，36（5）：597-601.

［7］Li ZG，Zhang W，Grunberger G，et al.Hippocampal neuronal apoptosis in type 1 diabetes［J］.Brain Res，2002，946（2）：221-231.

［8］Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications［J］.Nature，200l，414（6865）：813-820.

［9］D′Amours D，Desnoyers S，D′Silva I，et al.Poly（ADP-ribosyl）ation reactions in the regulation of nuclear functions［J］.Biochem，1999，342（Pt2）：249-268.

［10］Desrocher M，Rovet J.Neurocognitive correlates of type 1 diabetes mellitus in childhood［J］.Child Neuropsychol，2004，10（1）：36-52.

［11］Reske-Nielsen E，Lundbaek K.Diabetic encephalopathy.Diffuse and focal lesions of the brain in long-term diabetics［J］.Acta Neurol Scand Suppl，l963，39（4）：Suppl4：273-290.

［12］Northam EA，Rankins D，Cameron FJ.Therapy insight：the impact of type 1 diabetes on brain development and function［J］.Nat Clin Pract Neurol，2006，2（2）：78-86.

［13］Perros P，Deary IJ，Sellar RJ，et a1.Brain abnormalities demonstrated by magnetic resonance imaging in adult IDDM patients with and without a history of recurrent severe hypoglycemia［J］.Diabetes Care，1997，20（6）：1013-1018.

［14］Pacher P，Szabo C.Role of poly（ADP-ribose）polymerase l（PARP-1）in cardiovascular diseases：the therapeutic potential of PARP inhibitors［J］.Cardiovasc Drug Rev，2007，25（3）：235-260.

（编辑陈姜）

Protective Effect of PARP Inhibitor on Cortical Neurons in Streptozotocin-induced Diabetic Rats

WU Xiao-li，WANG Zhi-min，LIANG He-bin，HAO Ying，ZHENG Dong-ming，GUO Yang

（Department of Neurology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110021，China）

Objective To investigate the effect of PARP inhibitor 3-aminobenzamide（3-AB）on cortical neurons in streptozotocin-induced diabetes mellitus（DM）rats and the mechanism.M ethodsA total of 60 rats were divided into 3 groups randomly：sham-operated control group，DM group and DM+3-AB group，20 rats in each group.Morris maze was used to detect learning and memory abilities in each group.Spectrophotometer assay was used to detect the levels of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and malondialdehyde（MDA）in cortex.Western blot was used to determine the expression of poly（ADP-ribose）polymerase 1（PARP1）in cortex.Immunohistochemical staining was used to determine the expression of caspase-3-immunoreactive neurons in cortex.ResultsDM rats showed significantly declined learning and memory abilities.Compared with the control group，the levels of SOD and GSH-Px were significantly reduced（P＜0.01）and the level of MDA was significantly up-regulated（P＜0.01）in the DM group.Compared with the DM group，the levels ofSOD and GSH-Px were significantly higher（P＜0.05）and the level of MDA was significantly lower in the DM+3-AB group（P＜0.05）.The expression level of PARP1 was significantly up-regulated in the DM group and was significantly decreased in the DM+3-AB group（P＜0.01）.The level of caspase-3 was significantly higher in the DM group than in the control group（P＜0.01），and was significantly decreased in the DM+3-AB group（P＜0.01）.Conclusion3-AB protected cortical neurons from apoptosis in DM rats by inhibition of PARP1 and alleviation of oxidative stress.

diabetes mellitus；poly（ADP-ribose）polymerase；cognitive impairment；oxidative stress

R743.32

A

0258-4646（2015）06-0481-04

国家自然科学基金（81000467）

吴晓黎（1973-），女，讲师，博士. E-mail：77kwuxiaoli@163.com

2015-01-07

网络出版时间：