蓝舌病病毒基因和蛋白的特点及利用

李辰龙，王洪斌*，宋新刚，孙心

（1.东北农业大动物医学院黑龙江哈尔滨150030；2.哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）

蓝舌病病毒基因和蛋白的特点及利用

李辰龙1，王洪斌1*，宋新刚2，孙心2

（1.东北农业大动物医学院黑龙江哈尔滨150030；2.哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）

蓝舌病病毒是引起绵羊、牛蓝舌病的病原。该病毒是一种结构复杂的RNA病毒，对其分子生物学特性的研究，可以阐明其致病机制和遗传学规律，有助于蓝舌病预防治疗的研究。国内对该病毒的研究起步较晚，本文简述了蓝舌病病毒基因结构和蛋白特点及对其的利用，为预防及治疗提供参考。

蓝舌病病毒；基因蛋白；免疫预防

蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）属于呼肠孤病毒科、环状病毒属，是环状病毒属的代表种。绵羊对BTV最易感，牛、山羊和鹿亦可感染该病毒。BTV是引起家养和野生反刍动物蓝舌病的病原体，几乎完全通过特定种类库蠓叮咬传播[1]。蓝舌病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告疾病名录中规定的A类传染病。该病对畜牧业造成了严重影响，导致了巨大的经济损失。我国对BTV的研究起步较晚。本文简述了蓝舌病病毒基因结构和蛋白特点及对其利用，为预防及治疗提供参考。

1 BTV的分子结构

BTV颗粒较大（直径约70～80 nm），呈20面体对称，无囊膜，由外层的核衣壳、核衣壳外的细绒毛状层以及10个大小不一的双股RNA基因片段组成。病毒颗粒的外层衣壳由VP2和VP5两种主要蛋白构成，内层衣壳由VP3、VP7)两种主要蛋白和VP1、VP4和VP6三种次要蛋白构成[2]。

2 BTV的基因组

BTV的基因组为双链、分节段RNA，以高度有序的形式存在于核芯中。BTV病毒有10个大小不一的双股RNA片段组成。10个基因片段分别编码7种结构蛋白 (VP1-VP7)和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3a、NS3b)。10个独立的RNA片段分别命名为L1-3、M4-6、S7-10除S10节段外每个节段编码一种蛋白[3]。

3 BTV蛋白的功能

3.1 三种少量蛋白VP1、VP4、VP6

BTV病毒进入易感细胞的过程中会脱去外层衣壳，形成由5种结构蛋白(VP1、VP3、VP4、VP6和VP7)和10条基因组dsRNA组成的核芯颗粒。

VP1蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性[4-5]，表达的重组VP1蛋白在缺少其他核芯蛋白的情况下，依然可以有效地进行RNA的合成；而且其不仅能以病毒自身的RNA为模板进行RNA合成，还可以以外源RNA为模板合成RNA。但自然条件下，BTV的VP1蛋白不会以宿主RNA为模板进行RNA合成。

VP4特异性识别病毒自身RNA的机制目前还不明确。

VP6蛋白富含赖氨酸和精氨酸，可以结合并催化dsRNA解螺旋，VP6蛋白核酸结合活性具有浓度依赖性，而且与构象有关，其可以催化粘末端或平末端dsRNA解螺旋。VP6蛋白较保守，被认为是一种群特异性抗原[6]。

3.2 四种衣壳蛋白VP2、VP3、VP5、VP7

3.2.1 两种内衣壳蛋白VP3、VP7分别有L3和S7节段编码。

病毒的内衣壳由VP3和VP7组成，包裹着3种少量蛋白和病毒基因组，是病毒的核心颗粒，同时VP3和VP7构成的内衣壳是外层衣壳组装的基础。2种蛋白都高度保守，属群特异性抗原。

VP3蛋白在BTV病毒的衣壳成分中在最内层，对维持病毒核芯颗粒结构的完整性非常重要。VP3蛋白分为A和B两种构形，其化学组成完全相同，但有不同折叠方式。这种构象上的微小差异使VP3蛋白形成闭合的亚核芯层结构。VP3亚核芯层为VP7蛋白三聚体的附着提供了“脚手架”[7]。同时，VP3亚核芯层还与包裹的3种少量蛋白和基因组dsRNA紧密结合。VP3蛋白的保守性对于维持病毒粒子的结构非常重要。

VP7蛋白也具有保守性，这种保守性决定了病毒较强的群属特异性，VP7蛋白在病毒的血清学诊断方面用来判定群属性。VP7蛋白以三聚体形式组装在VP3蛋白构成的亚核芯层表面，形成内衣壳的外层。BTV的VP7蛋白含有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽基序，位于蛋白的168～170 aa位，RGD基序是病毒在宿主体内整合家族蛋白识别的一种配体位点，介导病毒与宿主细胞膜的吸附[8]。因此，VP7蛋白除了参与病毒颗粒的构成，还可以与宿主细胞膜结合。但VP7蛋白是否直接参与病毒核心颗粒的穿膜尚不清楚。

2.1 各组心脏彩超检测指标对比 与正常组相比，模型组小鼠LVEF、LVFS、LVPWDd、LVPWDs降低，LVAWd、LVAWs、LVIDd、LVIDs升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，阳性组、黄芩茎叶黄酮组 LVEF、LVFS、LVPWDd、LVPWDs升高，LVAWd、LVAWs、LVIDd、LVIDs降低，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

3.2.2 两种外衣壳蛋白VP2、VP5

二十面体构型的环状病毒核芯颗粒被外衣壳所包绕，外衣壳由VP2和VP5两种蛋白构成。VP2和VP5蛋白分别由L2和M5节段编码。

VP2蛋白是蓝舌病病毒结构蛋白中变异性最强的蛋白，其氨基酸序列的突变率为22.4%～73%。VP2蛋白位于病毒粒子的最外层，亲水性强，包含可被中和的血凝抑制（HI）抗体识别的血清型特异性表位，可以诱导产生中和抗体，虽然其部分抗原表位是保守的，但蛋白的突变改变了VP2蛋白的构象，导致表位的空间位置发生改变，使抗体无法中和病毒。VP2的氨基端很强的变异性，可能决定着病毒存在很多种的血清型，具有种特异性。BTV的VP2蛋白具有血凝素活性，可以与宿主细胞表面的血型糖蛋白A相结合。

VP5蛋白分子以三聚体形式存在于病毒粒子的外层衣壳中，120个三聚体整齐分布于核芯颗粒的VP7上。VP5蛋的保守性较VP2蛋白强，不同血清型BTV间同源性为70%以上。同VP2蛋白一样VP5蛋白也能诱导产生中和抗体。但因VP5蛋白的同源性较高，所以产生的中和抗体特异性不强，具有群特异性，VP5蛋白的近氨基端处存在两个“两亲性螺旋”，与蛋白的膜融合活性相关。VP5蛋白插入细胞膜中会破坏细胞膜的完整性，使细胞膜透性化[9-11]。

VP2和VP5组成的BTV的外衣壳蛋白可以引起细胞凋亡，但凋亡并不是由病毒的复制所引起，而是由病毒脱衣壳过程所引起。抑制内体的酸化可以抑制这种促凋亡作用。

3.3 四种非结构蛋白NS1、NS2、NS3a、NS3b

目前，在BTV病毒感染的细胞中已经检测到了4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3a和NS3b)。4种非结构蛋白在不同血清型BTV之间保守性很强[12]。非结构蛋白在病毒粒子的组装和运输过程中起重要作用。

NS1蛋白与NS3蛋白表达量之比可能决定了病毒释放方式。NS1蛋白介导病毒通过细胞裂解释放，而NS3蛋白介导病毒通过出芽方式释放。病毒释放方式的不同决定了对细胞损伤程度的不同。

NS2蛋白是病毒包涵体(VIB)的主要成分，存在病毒感染的细胞中，主要分布于细胞核附近。病毒核心颗粒的组装即发生在包涵体中。NS2蛋白可以被激酶催化磷酸化，磷酸化之后结合单链RNA的活性降低20%～30%，但磷酸化对于包涵体的形成是必须的[14]。

BTV的S10节段是基因组节段中最小的一个。S10基因的开放阅读框中有2个保守的起始密码子翻译分别产生2种氨基酸组成相似的蛋白-NS3a和NS3b，其在病毒感染的细胞中两种蛋白的表达量都很少。NS3a/NS3b蛋白翻译后，通过高尔基体运送至细胞膜，可以插入细胞膜中，破坏细胞膜的稳定性，可能与BTV的致病性相关[15]。NS3a/NS3b可以介导病毒粒子的运输和释放，来帮助病毒粒子的释放[16]。

4 应用

BTV可以在传播媒介库蠓等的昆虫体内，根据基因特点可以利用昆虫体内的RNA片段进行复制繁殖，且病毒的流行具有地域性特点，某一种或几种血清型的病毒只在固定的地区流行。

根据BTV基因结构和蛋白，基因片段多，且不同片段特异性编码复制一种蛋白的特点，可以制备基因缺失疫苗，把病毒产生致病性的基因剪切掉，制成基因缺失苗。如剪切掉控制VP5蛋白两个“两亲性螺旋”合成的基因、剪切掉S10基因阶段控制NS3a和NS3b蛋白合成的片段，然后将基因缺失的病毒在适合的细胞上进行传代培养，收获后加入保护剂制成冻干活疫苗。接种免疫后即可以有效的对动物进行保护，又避免了病毒在接触传递过程中的返祖增强。

还可以把同一地区流行的几种血清型的具有免疫原性的基因剪切合成在一起，制成基因重组的亚单位疫苗，这样免疫后可以对当地流行的不同血清型的蓝舌病病毒，都可以起到预防作用。

根据BTV血清型区域流行的特点，可以将区域流行的血清型的病毒，制成基因缺失苗或亚单位合成苗的活疫苗后，对经检测蓝舌病病毒阴性的动物，羊或牛进行免疫，然后让库蠓等传播媒介昆虫叮咬，病毒在其体内复制增殖，再叮咬其他动物就会对其进行接种免疫。也可以直接对库蠓等昆虫进行疫苗接种，然后再通过库蠓对其他动物的叮咬进行间接免疫。

5 总结

蓝舌病病毒是结构上最复杂的RNA病毒之一，由多种病毒蛋白和多节段的RNA基因组构成，给研究工作带来了较大的挑战性。国外BTV分子生物学方面的研究起步较早，目前已经可以通过RNA获得具有感染性的病毒粒子，并正在通过反向遗传技术对BTV的分子进行更加直接和接近真实的研究。这种方法将成为BTV分子生物学研究中一种更加有效的工具。目前，对于BTV蛋白功能的研究还存在许多矛盾之处，另外BTV在哺乳动物细胞和媒介昆虫细胞中复制机制的不同还有待阐明。BTV的分子生物学研究有助于阐明其致病机制和遗传规律，对于蓝舌病的防治具有重要意义，同时对阐明生物分子之间相互作用机制以及分子功能也有很大帮助。相信随着研究技术的进步，这些问题将会得到很好的解决。■（编辑：赵晓松）

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Characteristics and Utilization of Protein and Gene of Bluetongue Virus

Li Chenlong1,2,Wang Hongbin1,Song Xingang2,Sun Xin2
（1 Northeast Agricultural University Animal Medical College 150030；2 Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.Ltd,Harbin 150069）

Bluetongue virus is the cause of sheep,bovine bluetongue diseasepathogen.Bluetongue virus is a complex structure of the RNA virus,the research on the molecular biological characteristics,can clarify the pathogenesis and genetics law,have treatment to help blue tongue disease prevention study.The domestic research of bluetongue virus started late,this paper describes the disease virus gene structure and protein characteristics of blue tongue and to its use,in order to provide reference for the prevention and treatment.

bluetongue virus;gene protein;immune prevention

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.05.038

李辰龙，男，兽医师，长期从事兽用生物制品质量检验与生产工作。

*通讯作者：王洪斌，男，教授博士生导师，研究方向：兽医科学专业研究。