IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化在脑胶质瘤中表达及关联度分析☆

朱潇鹏唐军海黄国浩徐庆福臧振乐赵邦云王彬吕胜青

·论 著·

IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化在脑胶质瘤中表达及关联度分析☆

朱潇鹏*唐军海*黄国浩*徐庆福*臧振乐*赵邦云*王彬△吕胜青*

目的探讨脑胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenases 1，IDH1)突变和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）基因启动子甲基化状态及二者之间的关联性。方法收集手术切除并经病理证实的脑胶质瘤组织133例，采用巢式甲基化特异性PCR（nested methyla⁃tion-specific PCR，nMSP）法和甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）法联合变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）法检测脑胶质瘤中的MGMT基因启动子甲基化情况，直接测序法检测脑胶质瘤中IDH1基因的突变情况。采用χ2检验进行IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化关联度的统计分析。结果133例脑胶质瘤患者中MGMT基因启动子甲基化88例（66.17%），IDH1突变62例（46.62%）。IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化存在关联（P=0.01）。结论脑胶质瘤中IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化之间关联显著，提示两者在脑胶质瘤的发生发展中可能存在相互调节的作用；IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化是脑胶质瘤的重要疾病相关因素。

IDH1突变 MGMT甲基化 脑胶质瘤

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤。研究显示：肿瘤耐药影响患者化疗疗效，是胶质瘤患者预后不良的因素之一[1]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransfer⁃ase，MGMT）作为人体细胞内普遍存在的DNA修复蛋白，可通过还原DNA上的烷基化鸟嘌呤，逆转烷化剂对DNA的损害[2]。研究显示：经替莫唑胺治疗的胶质母细胞瘤中，MGMT基因启动子甲基化组患者生存时间明显长于非甲基化组，提示MGMT基因沉默是胶质母细胞瘤化疗效果好的因素之一[3]。异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）催化异柠檬酸氧化脱羧形成a-酮戊二酸，是细胞三羧酸循环能量代谢过程的关键酶[4]。在同一级别脑胶质瘤中伴有IDH1突变患者的存活时间明显长于野生型IDH1患者[5]，提示IDH1突变是脑胶质瘤患者预后重要指标。Molenaar RJ[6]对98例胶质母细胞瘤患者分析发现：IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化联合能更好的预测胶质母细胞瘤患者的生存时间。MGMT基因启动子甲基化和IDH1突变之间是否相关，进而相互调控，对阐明两者在胶质瘤发生发展及预后评估中具有重要意义。本研究对133例脑胶质瘤患者MGMT基因启动子甲基化及IDH1突变情况进行检测，进一步探讨分析他们之间的关联性，以期为胶质瘤患者的诊治提供更多理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象收集第三军医大学新桥医院神经外科2011年7月至2014年4月期间手术切除并经病理证实的人脑胶质瘤组织标本，共计133例。男77例，女56例，年龄7～87岁，平均（44.77± 15.88）岁。根据WHO（2007）神经系统肿瘤分类标准[7]，其中WHO I级2例，WHO II级44例，WHO III

级45例，WHO IV级42例。

1.2 直接测序法检测IDH1基因突变根据EZ⁃NA Tissue DNA Kit（OMEGA，美国）的操作手册抽提肿瘤组织DNA。分光光度计衡量所提DNA纯度和含量。选取A260/280在1.7～1.9的DNA进行下一步实验。根据人IDH1基因组序列（GenBank登记号：NM005896）设计IDH1引物，上游引物序列：5’-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3'，下游引物序列：5’-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3'。退火温度：60oC，PCR产物长度：129bp。DNA的纯化和测序由英潍捷基公司生物技术有限公司完成。

1.3 巢式甲基化特异性PCR（nested methyla⁃tion-specific PCR，nMSP）检测MGMT基因启动子甲基化采用DNA甲基化试剂盒（EZ DNA MethylationTMKit）对1μg基因组DNA进行亚硫酸盐修饰。然后以MGMT启动子区引物MGMT-O进行第一轮PCR扩增。上游引物序列：5'GGATAT⁃GTTGGGATAGTT3'，下 游 引 物 序 列 ：5' CCAAAAACCCCAAACCC 3'。以第1轮PCR扩增出的MGMT基因启动子区目的条带的PCR产物为模板，用MGMT基因甲基化引物（MGMT-M）和非甲基化引物（MGMT-U）进行第2轮PCR扩增。甲基化引物上游引物序列：5'TTTCGACGTTCGTAG⁃GTTTTCGC 3'，甲 基 化 下 游 引 物 序 列 ：5' GCACTCTTCCGAAAACGAAACG 3'；非甲基化引物上游引物序列：5'TTTGTGTTTTGATGTTTGTAG⁃GTTTTTGT 3'，非甲基化下游引物序列：5'AACTC⁃CACACTCTTCCAAAAACAAAACA 3'。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外光凝胶成像系统下观察结果并拍照。仅MGMT-U引物扩增出相应片段，判断为未甲基化；仅MGMT-M引物扩增出相应片段或MGMT-U引物和MGMT-M引物均扩增出相应片段，判断为甲基化。

1.4 甲基化特异性PCR结合变性高效液相色谱法（MSP-DHPLC）检测MGMT基因启动子甲基化

常规脱水，制作石蜡切片，寄送中国人民解放军空军航空医学研究所附属医院分子病理中心。石蜡切片DNA的提取，DNA的修饰，MSP以及DHPLC结果分析都依托该中心完成[8]。MGMT-M扩增产物和MGM-U扩增产物等比混匀，取5μL上样。PCR产物进样DNASep核酸分析柱（美国,Transge⁃nomic），Navigator软件分析结果。

1.5 统计学方法数据采用SPSS16.0进行统计分析。应用χ2检验比较两组分子标记发生率之间的差异及MGMT甲基化和IDH1突变关联度，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 IDH1突变的检测结果通过DNA测序发现，133例不同级别胶质瘤患者中检测出IDH1基因突变62例，总突变率为46.62%，其中61例样本存在IDH1基因的R132H突变，1例样本存在IDH1基因的R132S突变。WHO I级中无IDH1突变，WHO II、WHO III、继发性胶质母细胞瘤和原发性胶质母细胞瘤中IDH1突变率分别为75%、51.11%、50%和8.33%。经χ2检验，本实验组中WHO II(χ2= 32.91，P＜0.001)、WHO III(χ2=14.89，P＜0.001)和继发性胶质母细胞瘤中(χ2=4.29，P=0.038)IDH1突变率显著高于原发性胶质母细胞瘤。IDH1各级别突变的具体情况见表1。典型的IDH1基因R132H突变见图1。

2.2 MGMT基因启动子甲基化的检测结果在133例患者中，MGMT基因启动子甲基化患者88例（66.17%）。nMSP法对98例样本进行MGMT基因启动子甲基化检测，其中65例（66.33%）脑胶质瘤组织中发生MGMT基因启动子甲基化（图2）。用MSP-DHPLC法对35例样本进行检测，其中23例（65.71%）存在MGMT基因启动子甲基化（图3）。WHO I级、WHO II级、WHO III级、WHO IV级原发性和WHO IV级继发性胶质母细胞瘤中MG⁃MT基因启动子甲基化比率分别为50%、77.27%、64.44%、52.78%、83.33%。具体情况见表1。

2.3 IDH1突变与MGMT基因启动子甲基化的关联分析133例脑胶质瘤样本中IDH1突变和MG⁃MT基因启动子甲基化结果见表2。运用χ2检验进行关联度分析，IDH1突变与MGMT基因启动子甲基化关联显著（χ2=6.57，P=0.01），列联系数C= 0.217，二者低度相关。

3 讨论

表1 脑胶质瘤患者IDH1突变与MGMT甲基化情况

表2 IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化结果比较（χ2检验）

图1 IDH1基因突变检测图。A：IDH1基因R132H突变；B：IDH1基因未突变

MGMT作为一种人体细胞内普遍存在的DNA修复蛋白，能逆转烷化剂对DNA的损害，是胶质瘤对烷化剂治疗效果较好的因素之一[2]，也是临床上替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化疗药物敏感的重要依据，MGMT基因启动子高甲基化的患者对TMZ疗效明显[9]。本组133例脑胶质细胞瘤中，MGMT基因启动子甲基化的总发生率为66.17%。WHO I、WHO II、WHO III、原发性胶质母细胞瘤、继发性胶质母细胞瘤中的MGMT甲基化率分别为50%、77.27%、64.44%、52.78%、83.33%。之前研究发现，随着低级别星形胶质细胞瘤逐步演变为继发性GBM，肿瘤中发生甲基化的比例也随之增高。本组实验中WHO III级的MGMT突变率要低于WHO II和继发性胶质母细胞瘤，这可能和本实验未分肿瘤类型有关，也可能由于MGMT基因启动子甲基化发生于肿瘤形成的早期阶段所造成。

图2 nMSP法检测MGMT基因启动子甲基化。A：MGMT基因启动子甲基化；B：MGMT基因启动子未甲基化

图3 MSP-DHPLC法检测MGMT基因启动子甲基化。A：MGMT基因启动子甲基化；B：MGMT基因启动子未甲基化

有研究表明：IDH1突变好发于年轻胶质瘤患者，该突变早于TP53的发生，是胶质瘤发生发展

中的早期分子事件，IDH1突变的患者预后相对较好[10]。在本研究中采用直接测序法对133例胶质瘤进行IDH1基因突变检测，结果发现：89例WHO II-III胶质瘤患者中，56例（62.92%）存在IDH1的突变，5例继发性胶质母细胞瘤中3例（60%）存在IDH1突变，36例原发性胶质母细胞瘤中，3例（8.33%）存在IDH1突变。WHO II级、WHO III级胶质瘤中IDH1的突变率均高于原发性胶质母细胞瘤，继发性胶质母细胞瘤的IDH1突变率显著高于原发性胶质母细胞瘤。并且，IDH1突变在级别之间无递增关系。

IDH1在WHO II级、WHO III级胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤中的突变率远远高于在原发性多形性胶质母细胞瘤（pGBM）中的发生频率。这种分布特征与胶质瘤特有的CpG岛甲基化表型（Glioma-CpG Island Methylator Phenotype, G-CIMP)的分布特征具有很高的一致性[11]。Tur⁃can[12]将IDH1突变基因转入人永生化星形胶质细胞中，发现转入突变IDH1基因的星形胶质细胞经过50代培养形成了G-CIMP。说明离体实验中，IDH1基因突变能够引起高甲基化状态。在我们的实验中，对95例WHO II-III和继发性胶质母细胞瘤检测发现：68例（71.58%）检测出MGMT基因启动子甲基化，高于36例原发性胶质母细胞瘤中的19例（52.78%）。通过检测患者的IDH1突变以及MGMT甲基化状态发现，IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化之间存在关联。而这种关系有可能是突变的IDH1催化合成2-羟基戊二酸（2-hy⁃droxyglutarate，2-HG），大量积聚的2-HG抑制了DNA甲基双加氧酶(ten-eleven translocation 2，TET2)的活性,最终导致了MGMT基因启动子甲基化[12]。MGMT甲基化状态和IDH1突变之间关联性的具体分子机制有待进一步研究。

综上所述，本实验结果显示胶质瘤中MGMT甲基化状态和IDH1突变存在明显关联，在脑胶质瘤的生长过程中，IDH1基因突变及MGMT甲基化状态可能存在相互调节的作用，具体机制有待进一步研究。二者结合对判断患者预后，指导临床为患者制定更合理的化疗方案具有重要的参考意义。

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R739.41

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2014-11-19）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.02.010

☆ 国家自然科学基金（编号：81272783）和重庆市卫生局科研课题（编号：2012-2-305）资助

* 第三军医大学新桥医院神经外科（重庆 400037）

△ 重庆市永川区人民医院