瑞舒伐他汀钙对慢性高血压大鼠脑白质病变及空间认知功能的影响

郑璐范玉华蓝琳芳姬晓昙

·论 著·

瑞舒伐他汀钙对慢性高血压大鼠脑白质病变及空间认知功能的影响

郑璐*范玉华*蓝琳芳△姬晓昙*

目的探讨瑞舒伐他汀钙对慢性高血压大鼠的脑白质病变及其空间认知功能障碍的影响。方法雄性Sprague-DawIey大鼠49只，随机分为假手术组、高血压组和瑞舒伐他汀钙治疗组（10 mg/kg）。高血压组和瑞舒伐他汀钙治疗组采用双肾双夹法制作易卒中型肾血管性高血压大鼠（stroke-prone renovascular hyperten⁃sive rat,RHRSP）模型，定期监测血压。水迷宫实验检测空间记忆功能；Luxol fast blue染色观察脑白质疏松程度；免疫荧光法观察额叶皮层β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）在大脑皮层的沉积分布；原位末端转移酶标记染色法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL）观察额叶皮层细胞凋亡水平。结果RHRSP大鼠造模后血压逐渐升高，明显高于假手术组(P＜0.01)；瑞舒伐他汀钙较高血压组逃避潜伏期时间明显缩短(P＜0.01)，3组大鼠跨越平台次数分别为(4.55±1.23)、(1.00±0.80)、(3.79±0.95)，差异有统计学意义(P＜0.01)。与高血压组相比，瑞舒伐他汀钙可改善脑白质疏松程度(P＜0.01)，减少额叶皮层区Aβ沉积（17.47±3.59 vs.4.42±1.57，P＜0.01）及细胞凋亡（37.84±4.73 vs.14.42±2.43，P＜0.01）。结论瑞舒伐他汀钙可改善慢性高血压大鼠的脑白质病变，减少额叶皮层区Aβ沉积以及细胞凋亡从而保护大鼠的空间记忆功能。

高血压 脑白质病 认知障碍

高血压是多种疾病的危险因素，可引起多种并发症。目前研究发现，慢性高血压与认知功能损害密切相关[1]，高血压病患者认知功能损害的研究正在受到越来越多的关注[2]。众多的研究表明，脑白质病变可能是高血压造成认知功能损害的一个重要过程[3-6]。脑白质病变（white matter lesions，WML）又名脑白质疏松（leukoaraiosis），是脑小血管病变(small vessel disease，SVD)的重要类型之一。高血压是脑白质病变的一个重要的危险因素[7-8]。他汀类药物（Statins）是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，近年来在缺血性卒中的一级预防和二级预防中扮演一个不可或缺的角色。本实验采用易卒中型肾血管性高血压大鼠(stroke-prone reno⁃vascular hypertensive rat，RHRSP)研究瑞舒伐他汀钙对慢性高血压大鼠的脑白质病变及空间认知功能的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备采用体重为80～90 g的健康SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠49只（广东省实验动物中心）。随机分成假手术组(n=11)、高血压组(n=19)和瑞舒伐他汀钙组(n=19)。按双肾双夹法[9]复制RHRSP模型。假手术组未钳夹肾动脉。

1.2 血压测定及药物干预不同时间点经尾动脉测定收缩压(AD Instruments Pty Ltd，澳大利亚)。瑞舒伐他汀钙组于术后8周灌胃给药，10 mg／(kg·d)(可定，阿斯利康制药有限公司,生理盐水配制成4 mg/mL混悬液)，高血压组和假手术组均给予等量生理盐水，连续给药12周。

1.3 水迷宫实验评价空间记忆能力术后20周进行Morris水迷宫[10]实验。将目标平台置于第2象限，连续训练7 d。第1天为适应性训练，结果不计。第2天至第6天为获得性训练，记录大鼠找到平台的时间为逃避潜伏期。第7天为空间探索实验，撤走平台，记录60 s内大鼠穿越目标区域次数。

1.4 脑组织准备术后20周，所有大鼠应用4%多聚甲醛经主动脉灌注固定，快速取脑，4%多聚甲醛固定24 h，随后置入10%、20%、30%蔗糖4℃梯度脱水。OCT包埋后行冠状面连续冰冻切片，片厚10µm。

1.5 Luxol fast blue神经纤维染色取冰冻切片放入95%酒精中浸洗5 min，再放入0.1%Luxol fast blue染液中于56℃烘箱过夜，0.05%碳酸锂溶液初步分色，70%乙醇溶液内进一步分色。流水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。在光学显微镜下观察，对胼胝体、尾状核、外囊和内囊区域进行WML严重程度评估，参照Wakita H等[11]分级方法：0级，正常；1级，神经纤维结构紊乱；2级，明显空泡形成；3级，有髓神经纤维消失。

1.6 间接免疫荧光检测额叶皮层Aβ沉积取冰冻切片行免疫荧光法检测。一抗为兔抗大鼠Aβ3-16（1:100，Convance），4℃冰箱静置18 h，加入山羊抗兔荧光二抗（1:1000 CST）避光室温孵育1 h，水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.7 TUNEL法检测凋亡细胞取冰冻切片按TU⁃NEL试剂盒说明书（Roche）进行染色，水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察额叶皮层TUNEL阳性细胞。

1.8 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计学分析,满足正态分布的定量数据以(±s)表示。3组大鼠间收缩压值及水迷宫逃避潜伏期时间采用重复测量方差分析，使用Greenhouse-Geisser法校正方

差，若存在交互效应，进一步采用多元方差分析方法检验组别和时间的单独效应；WML分级采用卡方检验；TUNEL阳性细胞个数使用单因素方差分析。差异有统计学意义时用LSD-t检验行两两比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血压监测结果3组大鼠术前收缩压值差异无统计学意义（P=0.618），RHRSP术后收缩压逐渐升高，于术后16周趋于平稳，收缩压平均值达213 mm Hg。术后高血压组和瑞舒伐他汀钙组大鼠术后各时间点收缩压值差异均无统计学意义（P＞0.05），且术后两组血压水平均显著高于假手术组(表1)。

2.2 水迷宫试验在定位航行试验中，3组大鼠逃避潜伏期随试验天数逐渐递减(图1A)，第3、4、5、6天的训练中，瑞舒伐他汀钙组及假手术组的逃避潜伏期时间均明显低于高血压组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。空间探索实验显示，3组大鼠跨越平台次数分别为(4.55±1.23)、(1.00±0.80)、(3.79± 0.95)。高血压组大鼠跨越平台次数明显少于假手术组及瑞舒伐他汀组大鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）(图1B)。

2.3 Luxol fast blue神经纤维染色与假手术组及瑞舒伐他汀钙组相比，高血压组大鼠白质区（胼胝体、内囊、外囊、尾状核）疏松明显，以胼胝体最为严重，出现神经纤维的排列紊乱，纤维疏松、断裂成海绵状，弥漫的空泡形成。假手术组白质内神经纤维较为紧密。瑞舒伐他汀钙组胼胝体、外囊有少量神经纤维排列紊乱，轻度疏松，较少空泡形成。WML分级显示，瑞舒伐他汀钙组分级明显低于高血压组，在胼胝体、尾状核、外囊和内囊差异均有显著性意义,(P＜0.01)(图2)。

图1 假手术组、高血压组和瑞舒伐他汀钙组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期（A）及跨越平台次数比较（B）1）：与高血压组经LSD-t检验，P＜0.01

表1 假手术组、高血压组和瑞舒伐他汀钙组大鼠收缩压变化情况

2.4 额叶皮层Aβ沉积Aβ3-16免疫荧光染色显示：在假手术组额叶皮层中未见到Aβ免疫反应表达，双肾双夹术后20周高血压组额叶皮层区可观察到较多的细胞外基质Aβ沉积，而瑞舒伐他汀钙治疗后的大鼠额叶皮层Aβ阳性染色明显减少（图3 A）。瑞舒伐他汀改组的额叶皮层Aβ沉积分布明显低于高血压组（P＜0.01,图3 B）。

2.5 额叶皮层凋亡表达假手术组额叶皮层区极少TUNEL阳性细胞表达。与之比较，高血压组额

叶皮层可见大量TUNEL阳性细胞着色，细胞皱缩，细胞核固缩。而瑞舒伐他汀钙组额叶皮层区TUNEL阳性细胞表达较少（图4A）。较高血压组比较，瑞舒伐他汀钙组TUNEL阳性细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（图4B）。

3 讨论

图2 假手术组、高血压组和瑞舒伐他汀钙组大鼠脑白质各区域（A）神经纤维染色图片(Luxol fast blue染色200×)及各组分级比较（B）1）：与高血压组经LSD-t检验，P＜0.01

图3 假手术组、高血压组和瑞舒伐他汀钙组大鼠（A）额叶皮层Aβ沉积表达（200×）；（B）各组Aβ沉积分布比较 1）：与高血压组经LSD-t检验，P＜0.01

脑白质病变患者常常伴随认知功能受损的表现，但其具体的神经机制目前尚不明确。有学者观察到MRI上的白质疏松进展与认知损害程度不能完全匹配[12]，脑白质病变与认知功能障碍的关系尚存争议[13-15]。脑白质是维持大脑皮质和皮质下结构联系的重要枢纽。慢性高血压破坏了白质

结构的完整性，造成额叶-皮质下环路遭到破坏，导致神经元之间、额叶-皮质和皮质下中枢之间联络中断，进一步引起特定脑区的认知障碍[16-19]。额叶在认知过程中占有重要的地位。我们的研究观察到，高血压组大鼠认知功能损伤严重，额叶皮层区凋亡细胞的表达增多，提示慢性高血压除了脑白质区域的损伤外，额叶皮层部位的改变也值得关注。同时我们观察发现额叶区域Aβ聚集增加。Aβ蛋白是阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）老年斑的主要成分，Aβ在脑内的聚集和沉积造成神经元的毒性损伤及炎症反应的发生[20-21]。有研究者采用正电子发射断层显像术（PET）观察到，AD患者的Aβ表达与脑白质疏松程度呈正相关。这可能是由于脑白质病变中，脑小血管内皮细胞、基底膜功能丧失，血脑屏障结构破坏[23]，造成Aβ代谢受阻，积聚增多，进一步加重AD的病理损伤。

目前，他汀类药物对认知的改善作用仍然存在争议[24]。Mok等[25]的研究表明他汀类药物能够延缓WML的进程，减少脑白质损害的体积。Cra⁃mer等[26]经过5年的随访发现他汀类药物能降低患者认知功能损害的风险。我们的研究结果显示，使用瑞舒伐他汀钙治疗后的慢性高血压大鼠，其病理染色显示神经纤维断裂明显减轻，空泡形成减少，脑白质疏松程度明显改善；同时额叶皮层区凋亡细胞的表达及Aβ聚集减少，与高血压组相比差异有统计学意义，提示瑞舒伐他汀钙可改善慢性高血压大鼠的脑白质病变，并减轻额叶皮层区的神经损伤。同时瑞舒伐他汀钙组大鼠逃避潜伏期时间明显缩短，穿越平台次数增多，说明瑞舒伐他汀钙可改善慢性高血压大鼠的空间认知功能。

本研究初步探讨了瑞舒伐他汀钙对慢性高血压大鼠脑白质病变的改善及空间认知功能的保护作用，为进一步研究瑞舒伐他汀钙改善高血压性脑白质病变的机制提供了一定的研究依据。不足之处是未能深入研究脑白质病变影响认知功能的具体机制。此外，瑞舒伐他汀钙对脑白质病变的改善作用机制仍需进一步探讨。

图4 假手术组、高血压组和瑞舒伐他汀钙组大鼠（A）额叶皮层区TUNEL+细胞表达（200x）及（B）各组TUNEL+细胞比较 1）：与高血压组经LSD-t检验，P＜0.01

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Effect of rosuvastatin on white matter lesion in chronic hypertensive rats

.ZHENG Lu,FAN Yuhua,LAN Lin⁃fang,JI Xiaotan.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China. Tel：020-87755766-8292.

ObjectiveTo investigate the potential effects of rosuvastatin on white matter lesion and spatial memo⁃ry function in chronic hypertensive rats.MethodsFourty-nine male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group,vehicle-treated group,and rosuvastatin-treated group(10 mg/kg)．A model of stroke-prone reno⁃vascular hypertensive rat(RHRSP)was induced by using the two-kidney two clip method in the vehicle-treated group and the rosuvastatin-treated group.Blood pressure was monitored regularly.Morris water maze experiment was conduct⁃ed to assess spatial memory function.Luxol fast blue stanning was used to examine the degree of leukoaraiosis.Immuno⁃fluorescence and electron microscopy was used to detect β-amyloid deposits.TUNEL staining was used to assess apopto⁃sis.ResultsThe blood pressure of RHRSP increased progressively after operation．Blood pressure was significantly high⁃er in RHRSP than in sham-operation group(P＜0.01).The escape latencies of the rosuvastatin-treated group were mark⁃edly shorter in RHRSP than in sham-operation group(P＜0.01).The numbers of crossing hidden platform in the 3 groups of rats were 4.55±1.23,1.00±0.80 and 3.79±0.95 times.There were significantly differences in numbers of crossing hid⁃

Hypertension White matter lesion Cognition dysfunction

R743.3

A

2014-12-26）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.02.006

☆ 国家自然科学青年基金（编号：81000514）；广东省自然科学基金项目（编号：s2013010015840）

* 中山大学附属第一医院神经科,教育部国家重点学科,卫生部国家临床重点专科,广东省重大神经疾病诊治研究重点实验室（广州510080）

△ 香港中文大学威尔斯亲王医院内科与药物治疗系

den platform among three groups(P＜0.01).Luxol fast blue stanning showed that the grading scores for WML were lower in the rosuvastatin-treated than in the vehicle-treated group(P＜0.01).Rosuvastatin significantly decreased the burden of Aβ deposits（17.47±3.59 vs.4.42±1.57，P＜0.01）and the TUNEL+cells（37.84±4.73 vs.14.42±2.43，P＜0.01）in the fron⁃tal cortex when compared with the vehicle-treated group.Conclusions Rosuvastatin may ameliorate spatial memory func⁃tion through attenuation of white matter lesion,Aβ deposits and apoptosis.