2011年发热患者血检疟原虫血片制作及染色过程回顾性分析

许月娟

2011年发热患者血检疟原虫血片制作及染色过程回顾性分析

许月娟

为了提高疟原虫检出率, 选取本院发热患者末梢血制成厚薄血片进行染色镜检, 通过对血片的制作加以标准化, 染液严格按标准配置, 并对染色各步骤严格控制, 做出的血片染色良好, 背景清晰, 极大方便了疟原虫检查, 提高了疟原虫检查的工作效率。

疟原虫；血片；染色

疟疾是由疟原虫寄生于人体、经蚊传播的寄生虫病, 临床表现以周期性发冷、发热、出汗和脾大、贫血为特征。为按期实现本县消除疟疾任务目标, 落实好各项防治措施, 根据《山东省全球基金疟疾项目两年工作计划》和《山东省消除疟疾实施方案》的要求, 结合本县实际防控, 制定了具体的技术方案, 对全县各医疗卫生单位的检验人员进行了全员培训, 现将血片制作及染色过程中的注意事项总结如下。

1 血片制作之前, 一定要将玻片清洗干净, 玻片的清洁与否影响血片的质量。新载玻片常有游离碱质, 应用清洗液或10%盐酸或铬酸洗液浸泡24 h, 然后再彻底清洗, 晾干, 最后用干净柔软的棉巾将玻片擦净晾干［1］。已用过的载玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1～2 d, 或浸泡于煮沸的5%肥皂水1 h左右, 再移到新配置的洗涤剂溶液中1～2 h, 再用热水将肥皂和血膜洗去, 用清水反复冲洗, 然后擦干或烤干备用［2］。

2 将血片分为6等份, 第1、2格贴标签及编号备用, 厚血膜涂在第3格中央, 薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部［3］。用推片的左下角, 从取血部位刮取4～5 μl血量, 使血滴与平置的载玻片接触, 用推片的一角将血由内向外旋转2～4圈,涂成厚薄均匀, 直径为0.8～1.0 cm左右的圆形厚血膜, 过厚易于脱落, 过薄达不到检出率的要求。

制薄血膜时, 用推片一端边缘的中点, 从取血部位取1～1.5 μl血量, 使血滴与平置的载玻片接触, 待血液沿推片边缘展开约2 cm长度时(玻片宽度为2.5 cm, 即两边稍留一点),使推片与载玻片呈30～45°, 均匀而迅速的轻轻从右向左推成舌状薄膜, 制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞,细胞之间互相接触而不相互重叠, 每张载玻片上分别做1个薄血膜和1个厚血膜。至此, 1份完整的血检疟原虫的血片制作完成。薄血膜中疟原虫形态完整, 被感染红细胞未被破坏, 容易识别和鉴别虫种, 但原虫密度低时容易漏检。厚血膜由于原虫集中易检获, 检出率是薄血膜的15～25倍, 但制片过程中红细胞溶解, 原虫形态有所改变, 虫种鉴别较困难。

3 将制作好的血片放在阴凉干燥处自然晾干, 室温大约在25～30℃左右, 干燥4 h左右后, 用甲醇固定薄血膜, 厚血膜端稍高于薄血膜端, 让甲醇从薄血膜流下, 让薄血膜自然晾干。甲醇固定完薄血膜后, 再对厚血膜进行溶血。用蒸馏水2～3滴, 均匀覆盖在厚血膜上1～2 min, 滴蒸馏水时要轻轻的滴, 待厚血膜中央的红色随水晃动时, 轻轻冲洗去厚血膜上的蒸馏水, 待厚血膜自然干燥后染色。夏天标本尽可能在24～48 h内固定染色, 冬天也不能超过72 h。放置时间越久,血膜越不易溶血脱色, 染色效果也差。

4 吉氏染液的配置 取吉氏粉10 g, 甘油500 ml, 将吉姆萨粉10 g置于研钵中, 加入少量甘油小心充分研磨, 溶解缓慢,应边加边磨, 至500 ml甘油加完研磨均匀为止。然后倒入1000 ml的容量瓶(或有塞玻璃瓶中)中［4］。每次加入少量甲醇至研钵中, 多次洗涤研钵中的残留液, 至洗净为止, 洗液均并入容量瓶中。最后加全部剩余甲醇正好稀释至1000 ml刻度, 塞紧瓶塞, 充分摇匀, 置于55～60℃ 水浴中或温箱内24 h,或室温内3～5 d。期间经常用力摇动此溶液几分钟。然后可储存至玻璃瓶中塞紧备用。伊红在水溶液中遇到美兰或天青即可互相化合而产生沉淀, 从而失去染色能力, 因此, 吉氏母液绝对不能进水。

5 将染色储备液(母液)加入蒸馏水作1:20～1:15稀释(取吉氏母液1～2滴, 加中性蒸馏水10～30滴)混合均匀后, 将适量染液覆盖厚薄血膜, 染色20～30 min, 轻轻漂洗掉染液即可。然后将染色后的玻片用清水冲洗干净后, 将它放在阴凉干燥处晾干即可。至此, 一张完整的合格的血片制作完成［5］。

6 血片染色好坏除了玻片是否清洁, 血片制作质量和染色技术等有关外, 还受到以下几个因素的影响。

6.1 染料和溶剂的质量以及染液的新旧。必须用分析纯的甲醇和中性甘油, 而且配置时所用的器具必须干净而无水分。如果试剂不纯, 常使配置的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。新配置的染液染色效果较差, 染液存放时间越长, 染色力越强。盛放染液的瓶子应加塞密闭, 以防吸潮而影响染液质量。

6.2 染液的稀释浓度及稀释后使用时间。染液的浓度高,则着色快而深, 颜色常偏碱。染液浓度低, 则着色慢而浅,颜色偏酸。稀释后的溶液必须当时使用, 一般在30 min内染色力最强。

经过对发热患者进行涂片镜检, 也得出了很多心得体会,对血片制作染色过程中的温度、染液浓度、染色时间的长短、及染液浓度的配制和时间的相关性等方面的技巧有了一定的掌握。因此, 在全省的疟疾防治工作中本县具备了强有力的技术支持, 建立了健全的防疟队伍, 从而为早日实现中国消除疟疾行动计划中的目标要求, 尽每一位医务工作者最大的努力。

［1］ 于立勇, 鲁玲, 周映儿.637例发热病人疟原虫片复检质量分析.中国地方病防治杂志, 2014, 29(4):276-277.

［2］ 谢轶青, 邹永根, 冷瑞珍, 等.血涂片检查疟原虫的质量评价.中国热带医学, 2004, 4(5):760-761.

［3］ 张小萍, 金小林, 高琪, 等.江苏省不同地区的疟疾监测.中国寄生虫防治杂志, 2001, 14(2):84-86.

［4］ 吴英松, 李明, 董文其, 等.恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2001, 19(2):80-83.

［5］ 李锦辉, 黄亚铭, 郭传坤, 等.广西三个虐区县(市)抗疟措施质量与效果调查.中国热带医学, 2007, 7(4):590-592.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.22.194

2015-01-12］

256219 山东省邹平县好生镇卫生院