黄芩汤抗TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎活性研究

巢　蕾，曹雨诞，陈佩东

(1.江苏省中医院药剂科,江苏 南京　210029;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京　210046)



黄芩汤抗TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎活性研究

巢蕾1，曹雨诞2，陈佩东2

(1.江苏省中医院药剂科,江苏 南京210029;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京210046)

摘要：目的 研究黄芩汤水煎液中主要成分及对2,4,6-三硝基苯磺酸钠 (TNBS)造模balb/c小鼠的溃疡性结肠炎的作用。方法HPLC-MS法分析水煎液成分。雄性balb/c 小鼠随机分为空白对照组，TNBS模型组，柳氮磺嘧啶阳性对照组(500 mg·kg-1)，黄芩汤水煎液1，2，4 g·kg-1治疗组。TNBS造模7 d后，研究各组小鼠的结肠病理评分、微观评分、体质量、小鼠结肠长度和血清髓过氧化物酶(MPO)。结果与标准品对照，黄芩汤水煎液中含有复方中主要成分，黄芩汤水煎液可使TNBS造模balb/c小鼠的体质量明显增加，改善身体的一般状况和小鼠结肠黏膜的损伤，下调MPO。结论黄芩汤水煎液中含有各药物的主要成分，对TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有较好的治疗作用。

关键词：溃疡性结肠炎;黄芩汤;髓过氧化物酶;液质联用;2,4,6-三硝基苯磺酸钠

溃疡性结肠炎(UC)是一种常见的非透壁性肠道炎症[1]，尽管目前其确切的发病机制尚不清楚，但一般认为是由于肠道细菌过度活跃引发的黏膜免疫反应所引起的疾病[2]。黄芩汤由黄芩、炙甘草、白芍和大枣组成，临床主要治疗腹泻、呕吐、恶心等肠道疾病，对抗癌药物引起的肠黏膜损伤具有修复作用[3]。黄芩汤中各药物主要含有黄酮类[4-5]、皂苷类[6]、单萜苷类[7]和三萜类[8]等成分，并且具有抗炎和调节免疫作用[9-12]。近年对黄芩汤的抗溃疡性结肠作用研究有一定进展[13-14]，但对黄芩汤作用的机制及物质基础研究尚不明确。本实验对黄芩汤水煎液的化学成分进行了液质联用分析，并对其抗2,4,6-三硝基苯磺酸钠(TNBS)诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎的活性进行了研究，为进一步研究提供了依据。

1材料

1.1药物和试剂黄芩汤由黄芩、白芍、炙甘草和大枣组成，分别购自内蒙古(No.121201)、安徽(No.120809)、山东和河北(No.121126)，由南京中医药大学中药鉴定教研室吴德康教授鉴定为黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、白芍(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大枣(ZiziphusjujubeMill.)。芍药苷、黄芩苷、齐墩果酸、乌苏酸、甘草酸购自中国药品鉴定所，氧化芍药苷、羟基芍药苷、白桦脂酸、甘草次酸、甘草查尔酮A、甘草苷、异麦角甾苷、白杨素购自成都曼思特公司，汉黄芩素、千层纸素A、黄芩素分离自本实验室。 TNBS购自sigma公司，柳氮磺嘧啶(SASP)，上海三维公司，批号20130514，戊巴比妥钠，髓过氧化物酶(MPO)试剂盒,南京建成公司,批号20140110。

1.2实验动物雄性balb/c小鼠(20～24 g)，购自青龙山动物中心，动物许可证号SCIXK(苏) 2012 -0004。

1.3实验仪器1290液相色谱系统，6460三重四级杆质谱系统(安捷伦)，数据采集和处理应用MassHunter 工作站软件 (Version B.03.00)完成 。

2方法

2.1黄芩汤水煎液的制备黄芩300 g，白芍200 g和炙甘草200 g，大枣300 g[3]，以8倍量水煎煮3次， 每次1 h。所得浸膏得率为32.6%，分别配制成1、2、4 g·kg-1给药剂量。

2.2HPLC-MS分析条件液相色谱条件为Kromasil C18(250 mm×6 mm,5 μm)色谱柱，柱温 30℃，流动相 A 为0.05%甲酸 ，B为乙腈，梯度洗脱(0～10 min, 85%～80% A; 10～35 min, 80%～75% A;35～55 min, 75%～70% A;55～65 min, 70%～60% A;65～90 min,60%～35%A;90～92.5 min,35%～5% A;92.5～102.5 min,5%A;102.5～110 min,5%～85%A;110～115 min, 85%A)；体积流量0.6 mL·min-1，进样3 μL，检测波长254 nm。质谱条件为电喷雾离子源，负离子模式扫描；干燥气温度350℃，干燥气流量10 L·min-1，离子源温度320℃，雾化气电压40 psi(1 psi=6.895×103Pa)，毛细管电压3 500 V。

2.3动物分组与给药小鼠饲养温度22～24℃，随机分为6组 (n=10)，分别为空白对照组，阳性对照组，TNBS模型组。给药组为黄芩汤水煎液1、2、4 g·kg-1剂量组。小鼠禁食24 h后，以戊巴比妥钠50 mg·kg-1麻醉，通过0.56 mm PE管将三硝基苯磺酸钠100 mg·kg-1注入小鼠结肠4 cm处造模。50%TNBS试剂0.1 mL 缓慢注入小鼠结肠，空白组注入50%乙醇。然后将小鼠垂直倒立，保持2～3 min，放回鼠笼[15]。空白对照组及模型组以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)给药，阳性对照组以柳氮磺嘧啶(500 mg·kg-1)给药，给药组为黄芩汤水煎液1、2、4 g·kg-1，持续7 d。

2.4样品采集造模7 d后，小鼠眼眶取血，然后处死。将小鼠腹膜剪开，取距肛门2 cm以上3～5 cm处结肠，以PBS液反复清洗，置于滤纸上吸干水分。取相同位置结肠，在10%福尔马林中固定24 h，用于病理切片。所取血液放置5 min后，3 000 r·min-1离心,取出血清后置于PE管，-80℃保存。

2.5结肠病理和组织学评价根据TNBS诱导的炎症损伤进行结肠病理评价：0级，没有损伤;1级，水肿，没有溃疡；2级，轻微溃疡，没有明显炎症；3级，溃疡伴有1处炎症；4级，2处或以上炎症伴有溃疡面积小于1 cm；5级，2处以上严重溃疡或大于1 cm炎症区域。结肠组织以4%多聚甲醛固定，脱水，随后嵌入石蜡，进行HE染色组织学评价：0级，正常结肠;1级，黏膜炎症；2级，炎症病灶于黏膜表层或下层；3级，病灶于肌层；4级，病灶位于绒毛膜；5级，严重溃疡和炎症[15]。

2.6髓过氧物酶评价小鼠血清MPO活力以spectrophotometer (Bio-Bad, USA)测定，波长460 nm ，按试剂盒标准程序进行测定[16-17]。

3结果

3.1黄芩汤水煎液HPLC-MS分析黄芩汤水煎液总离子流图见图1，其中A为混和对照品，B为黄芩汤水煎液。从分析结果可以看出，黄芩汤样品中含有包括黄芩中的黄芩苷等主要黄酮类成分，白芍中的芍药苷等单萜苷类成分，炙甘草中的甘草酸等三萜及黄酮类成分及大枣中的白桦脂酸等三萜类成分。

A混合对照品B黄芩水煎液样品

图1黄芩汤水煎液总离子流图

注：1.氧化芍药苷；2.羟基芍药苷；3.芍药苷；4.异麦角甾苷；5.甘草苷；6.麦角甾苷；7.黄芩苷；8.甘草素；9.黄芩素；10.甘草酸；11.千层纸素A；12.白杨素；13.汉黄芩素；14.甘草查尔酮A；15.甘草次酸；16.乌苏酸；17.白桦脂酸；18.齐墩果酸。

表1　黄芩汤对TNBS造模小鼠结肠病理评分、体质量、结肠和MPO的影响

注：与对照组比较*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较#P<0.05，▲P<0.01。

3.2病理学观察及损伤评分造模后，各组的体质量变化、结肠长度、宏观损伤评分和MPO结果见表1。

小鼠经TNBS造模后出现皮毛疏散、进食减少、懒动、腹泻和便血等症状。小鼠体质量下降明显，结肠部位表现出不同程度的红肿和溃疡。具体数据见表1。由此可以看出，模型组小鼠的结肠长度为(5.98±0.30)cm，而体质量下降(-19.23 ±2.15)%，与对照组比较明显下降。结肠病理评分和血清MPO活力则显著上升，与对照组比较均有显著性差异，表明造模成功。经过柳氮磺嘧啶和黄芩汤治疗后，结肠长度和体质量增长明显，而结肠病理评分和MPO活力则显著下降，与模型组相比较均有显著性差异，表明对溃疡性结肠炎有治疗作用，且黄芩汤三个剂量组呈现一定的量效关系。

3.3组织学评价对造模小鼠结肠组织的HE染色组织学评价发现，阳性对照组有黏膜的轻微浸润，空白组有正常上皮的黏膜，模型组显示了黏膜有炎性浸润并且伴有严重的结构扭曲，窦炎和隐窝脓肿，药物治疗组表明局部灶腺腔有凋亡细胞，但比模型组有较大改善,见图2。

4讨论

黄芩汤中主要成分具有抗炎、调节免疫作用。应用三硝基苯磺酸钠法制备的UC大鼠模型是探讨UC发病的免疫学机制和研究开发UC新药的一个理想模型，本实验选择TNBS模型造模。

通过HPLC-MS可以看出，黄芩汤水煎液中保留了各药物中主要活性成分，其中黄芩中的黄芩苷、白芍中的芍药苷、甘草中的甘草酸和大枣中的三萜苷元白桦脂酸等都存在于水煎液中。这些成分都具有调节免疫和抗菌、抗炎的作用,其中的黄芩苷、甘草酸等也是黄芩汤血清中的主要成分[18]。

造模后小鼠的结肠明显缩短，体质量下降明显，有便血、懒动等症状，而MPO活力显著增加是体内炎症的重要表现[19]。阳性对照组和各给药组与模型组相比，结肠长度显著增加，体质量恢复明显，MPO活力下降，结肠损伤恢复。本实验结果表明，黄芩汤水煎液对溃疡性结肠炎具有较好的治疗作用，且呈现一定量效关系。

目前，全球治疗溃疡性结肠炎的药物有100余种，而正在研究的药物多达近80种，包括水杨酸类药物如美沙拉嗪，肿瘤坏死因子拮抗剂如戈利木单抗，免疫抑制剂如芬戈莫德、山喜多 ，干细胞疗法药物如remestemcel-I，但这些药物停药后容易复发，长期应用副作用大。黄芩汤出自《伤寒论》，是“医圣”张仲景传世的“经方”之一，本实验研究了黄芩汤水煎液所含成分及其抗溃疡性结肠炎作用，为进一步研究其作用机制提供了依据。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.012

基金项目：南京中医药大学风险基金(No CX201202)

通信作者：陈佩东，男，博士，副教授，研究方向：中药化学及活性成分研究, E-mail:chenpeidong1970 @163.com

(收稿日期:2015-08-20,修回日期:2015-09-04)

Effect of huangqin decoction on TNBS induced ulcerative colitis in mice

CHAO Lei1,CAO Yu-dan2, CHEN Pei-dong2

(1.JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the main constituents and the effects of Huangqin decoction on 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) induced colitis in mice. Methods The decoction was analyzed by HPLC-MS, and the animals were randomly divided into 6 groups(n=10):normal control, TNBS control, positive control(500 mg·kg-1) and Huangqin decoction groups with 1,2,4 g·kg-1respectively. 7 days after the induction of colitis with TNBS, the effects were studied by pathological score, histological analysis, body loss, colon length as well as by determination of MPO.Results The decoction had the main compounds of the plants. After the treatment with the decoction, the body weight and colon length were increased, the microscopic and macroscopic score were lowered, and the level of serum MPO activity was markedly decreased. Conclusion Hangqin decoction has the main constituents from various plants, and is effective in the treatment of colitis induced by TNBS.

Key words：ulcerative colitis；huangqin decoction;MPO;HPLC/MS;2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid