正交法优选丹参提取工艺研究

高　杨，王　彬，秦昆明，陈丹妮，陈林伟，金俊杰，蔡宝昌

(1.南京中医药大学附属南京市中西医结合医院药剂科,江苏 南京　210014;

2.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京　210023;

3.国家中医药管理局中药炮制标准重点研究室,江苏 南京　210046;

4.南京海昌中药集团有限公司,江苏省企业研究生工作站,江苏 南京　210061)



正交法优选丹参提取工艺研究

高杨1，王彬2,3,4，秦昆明2,3,4，陈丹妮2,3，陈林伟2,3，金俊杰4，蔡宝昌2,3,4

(1.南京中医药大学附属南京市中西医结合医院药剂科,江苏 南京210014;

2.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京210023;

3.国家中医药管理局中药炮制标准重点研究室,江苏 南京210046;

4.南京海昌中药集团有限公司,江苏省企业研究生工作站,江苏 南京210061)

摘要:目的 优选丹参的提取工艺。方法以丹酚酸B及丹参酮ⅡA的提取率为考察指标，对丹参的提取工艺进行正交试验法，筛选出最佳提取工艺。结果优选出的丹参最佳提取工艺为：8倍量70%乙醇在70℃下加热回流提取90 min。结论优选得到的丹参提取工艺稳定可行。

关键词：回流提取；丹酚酸B；丹参酮ⅡA；正交试验

丹参，为唇形科鼠尾草属植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈等功效，是临床心血管疾病最常用中药之一，丹参多糖具有抗氧化、增强免疫力、护肝和降血糖等功效[1-3]。研究表明，以丹参为原料药材制成的不同剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、喷雾剂、口服液以及滴丸等，对人体的毒副作用均较小[4-7]。

丹参中主含水溶性的酚酸成分和脂溶性的二萜类成分，水溶性成分如丹酚酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸等，具有调节微循环、抗血栓、帮助组织恢复的作用。脂溶性成分如丹参酮型的二萜类化合物，主要有丹参酮ⅡA、ⅡB，隐丹参酮、异丹参酮I等，其中丹酚酸B和丹参酮ⅡA是丹参中水溶性和脂溶性成分的主要成分，二者都具有很多生物活性。丹酚酸B可以改善小鼠的学习记忆能力，抗肾纤维化等[8-10]，丹参酮ⅡA具有抗炎、抗氧化[3]以及抗癌[4]等作用。关于丹参的提取工艺有较多的报道，但是丹酚酸B在高温下易分解成紫草酸和丹参素，如图1所示。本文通过对丹参的提取温度、时间、次数以及溶剂(乙醇)浓度进行单因素考察，采取回流提取法，以丹酚酸B和丹参酮ⅡA的总含量作为指标，采用正交实验设计法优选丹参提取工艺，形成丹参的提取的最佳工艺参数，以此为充分利用该药提供重要的实验室依据。

图1丹酚酸B高温分解为紫草酸和丹参素

1材料

Shimadzu LC-20 AD高效液相色谱系统(日本岛津公司)，包含岛津LC-Solusion工作站、在线脱气机、SIL-20 A自动进样器、SPD-20 A紫外-可见光检测器、CTO-20 A柱温箱FA1104电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)。

丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品均购于成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为D-012-131112，D-008-131211,二者纯度均≥98%，用于含量测定。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂为分析纯。

丹参(批号：140405)，购于南京海源中药饮片有限公司，由南京中医药大学陈建伟教授鉴别分析为唇形科植物丹参SalviaMiltiorrhiza的干燥根茎，通过检验丹参饮片符合2010版颁布的《中国药典》标准。

2方法与结果

2.1实验设计根据前期单因素试验考察的结果，采用L9(3)4正交试验法对丹参提取工艺进行优选。以丹参中的丹酚酸 B和丹参酮 ⅡA的含量为评价指标，对提取时间(A)、温度(B)、溶剂浓度(C)、液体/材料(D)进行考察，因素水平见表1。

表1　丹参提取工艺因素水平表

2.2指标成分的含量测定

2.2.1色谱条件 YMC-Pack ODS-A色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱，0～5 min，30%～35% A；5～10 min，35% A；10～20 min，35%～75% A；20～25 min，75%～80% A；25～30 min，80%～85% A；30～35 min，85%～5% A；35～40 min，5% A，流速1.0 mL·min-1；柱温35℃，检测波长[3]：丹酚酸B 286 nm，丹参酮ⅡA 270 nm；进样量10 μL。对照品和待测样品的色谱图见图2。

图2混标(A)和丹参样品(B)的HPLC色谱图

2.2.2线性关系考察精密称取丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品若干，溶于甲醇，制成混合对照品母液，将母液逐级稀释为各成分质量浓度为7.9～395，1.62～162 mg·L-1的混合对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，纵坐标为峰面积，横坐标为对照品的浓度(mg·L-1)，制作标准曲线，拟合回归方程，结果见表2。

表2　丹酚酸B和丹参酮ⅡA的线性回归方程，相关系数和线性范围

2.2.3待测样品溶液的制备 取丹参粉末约2 g，精密称量，按正交试验表进行试验，滤过，合并滤液至100 mL量瓶中，分别加相应的提取溶剂至刻度，超声10 min，作为待测品溶液。精确移取待测样品溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得各提取液的待测液。

2.2.4方法学考察 精密度试验:精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱图。各主要色谱峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度好。

重复性试验:精密称定丹参粉末约2 g，同法取样6份，照“2.2.3”项下方法选取试验设计中每个因素的1个水平制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。各主要色谱峰面积RSD均小于2.5%，表明重复性良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进行测定。各主要色谱峰峰面积的RSD均小于2.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的混合提取溶液共6份，每份2 mL，精确称定，分别加入适量混合对照品溶液。精确移取样品溶液5 mL，以“2.2.3”项下方法制备待测样品溶液，计算回收率，丹酚酸 B和丹参酮ⅡA的平均加样回收率分别为100.34%和99.13%，RSD分别为1.43%和0.95%(n=6)。

2.3正交试验方案及结果分析 正交试验方案直观分析及方差分析结果见表3,4。本次正交设计以丹酚酸B和丹参酮ⅡA两者提取率之和为指标，将总指标结果带入正交试验结果，即得。

表3　提取工艺正交试验直观分析

表4　提取工艺正交试验方差分析

注：f= 2，F0.1( 2，2)= 9.00，F0. 05( 2，2)= 19.00。

直观分析结果表明，在所选因素水平范围内，按丹酚酸 B和丹参酮ⅡA两种成分含量总和进行判定，各因素对丹参提取工艺的影响依次为B>A>D>C，即提取温度>时间>液体/材料>乙醇浓度，且提取温度在提取过程中起重要作用(P<0.05)；由方差分析结果可见，因素A对试验结果影响不明显，最终选择A2B2C2D1作为本实验的最佳提取条件，即加入8倍量70%浓度的乙醇在70℃下加热回流提取90 min。

2.4工艺验证试验 根据正交试验结果筛选的工艺条件进行3批验证试验，结果见表5。以优化工艺作为标准进行丹参提取，其提取液中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量都较高。试验结果表明，所优化的提取工艺合理可行，且结果稳定可靠。

表5　提取工艺验证试验结果

3讨论

3.1评价指标的选择 丹酚酸 B和丹参酮 ⅡA为丹参的有效成分，较其他成分高，也是其水溶性成分和脂溶性成分的代表性成分，同时二者具有较高的生物活性，在治疗心血管疾病中有很好的治疗作用。选择丹酚酸B和丹参酮ⅡA作为丹参提取的指标性成分可以更全面地反映出丹参的提取效果。

3.2正交因素与水平的选择 在正交试验前，首先进行单因素考察，对提取工艺的因素与水平进行初步筛选。目前，有关丹参提取工艺报道颇多[11-14]，对提取时间、溶剂浓度以及液体/材料皆有报道，但是对提取温度对丹参提取效果的影响报道较少，由于丹酚酸B和丹参酮ⅡA在较高温度状态下都具有不稳定性，故本实验在相关研究的基础上增加提取温度作为丹参提取的考察因素。在单因素试验中设计了提取温度50～100℃等6个水平。结果表明，在相同的提取工艺条件下，70℃温度条件下提取出的丹酚酸B和丹参酮ⅡA得率相对较高。

本文优选丹参提取工艺，目的是用较简单的实验方案同时提取丹参中水溶性和脂溶性成分，以操作简便，节约成本，控制适当的提取温度减少丹参中的有效成分分解。本文运用高效液相色谱法来测定丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量，数据准确，重现性好，灵敏度高，能够较准确的测定丹参中有效成分的含量。

参考文献：

[1]Zhang W,Zheng L,Zhang Z,et al.Protective effect of a water-soluble polysaccharide from Salvia miltiorrhiza Bunge on insulin resistance in rats[J].Carbohydrate Polymers，2012,89(3):890-898.

[2]孙仁弟,徐向阳,宋燕青.丹酚酸B的药理研究进展[J].药物流行病学杂志,2012,21(9):458-462.

[3]Chiu TL,Su CC.Tanshinone ⅡA induces apoptosis in human lung cancer A549 cells through the induction of reactive oxygen species and decreasing the mitochondrial membrane potential[J].International Journal of Molecular Medicine, 2010,25(2):231-236.

[4]赵雪峰,魏敬妙,李勇,等.丹参酮ⅡA诱导体外胃癌细胞的自噬[J].中成药,2014,36(1):10-14.

[5]李绍林,张建军.丹参提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(12):45-47.

[6]王微,周国军,李焱,等.土壤水分对新鲜和采后干燥丹参根中活性成分含量的影响[J].安徽医药,2015,19(2):248-251.

[7]李育.丹参对人口腔黏膜白斑中MMP-2及MMP-9表达的影响[J].安徽医药,2015,19(3):573-575.

[8]潘丽,曹芳,朱月皓.丹毒常规疗法和分别联用丹参两种注射剂型疗效比较[J].安徽医药,2015,19(3):576-577.

[9]李妮娜,王举涛.气相色谱法对丹参中有机氯农药残留的分析研究[J].安徽医药,2015,19(4):656-659.

[10] 姜鸿，侯政，李丽,等.清血通脉颗粒喷雾制粒工艺的正交试验法优化[J].时珍国医国药,2015,26(4):882-883.

[11] 钱三立,李冰玉,吴君怡,等.丹参水提物一步制备丹参素乙酯的研究[J].天然产物研究与开发,2015,27(1):80-83.

[12] 王金军,林琳,李景令,等.丹酚酸B水解生产丹参素的工艺优化[J].天然产物研究与开发,2015,27(4):715-719.

[13] 陈林伟,秦昆明,徐雪松,等.中药指纹图谱数据库的研究现状及展望[J].中草药,2014,45(21):3041-3047.

[14] 陈林伟,秦昆明,朱艳汇,等.中药材产地加工的研究现状及展望[J].中国中药杂志,2015,40(4):602-606.

基金项目:江苏省自然科学基金项目(No BK20141093)；江苏省科技支撑计划——工业项目(No BE2012011)

通信作者：蔡宝昌，男，教授，博士生导师，研究方向：中药炮制机制及质量标准研究，E-mail:bccai@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.008

(收稿日期：2015-06-26，修回日期：2015-08-05)

Optimization of extraction process ofSalviaeMiltiorrhizae
by Orthogonal experiment

GAO Yang1，WANG Bin2,3,4,QIN Kun-ming2,3,4,et al

(1.DepartmentofPharmacy,NanjingIntegratedTraditionalChineseAndWesternMedicine

Hospital,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210014，China;

2.CenterforStandardizationofTraditionalChineseMedicineProcessing,NanjingUniversityofChineseMedicine,

Nanjing210023,China;3.ResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineProcessing,StateAdministrationof

TraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China;4.GraduateWorkstationinEnterprisesofJiangsuProvince,

NanjingHaichangChineseMedicineGroupCo.,Ltd.,Nanjing210061,China)

Abstract:Objective To establish a method to optimize and determine the extraction technology of Salviae Miltiorrhizae. Methods In this article, an orthogonal test was conducted, with salvianolic acid B and tanshinone IIA as indexes, to detect four factors, including the extraction time, extraction temperature, the dosage of ethanol and solvent to solid ratio, and to optimize the extraction process of Salviae Miltiorrhizae.Results Optimized extraction method was as follows:8 times the amount of 70% ethanol, reflux extraction 90 min at 70℃.Conclusion Optimized extraction technology of Salviae Miltiorrhizae is stable and feasible.

Key words:reflux extraction;salvianolic acid B;tanshinone ⅡA;orthogonal test