MicroRNA：从生物标志物到基因治疗

汤森路透

MicroRNA：从生物标志物到基因治疗

汤森路透

microRNA（miRNA）作为生物标志物和治疗靶点的价值已被公认。简介miRNA及其生物合成与功能，探讨 miRNA与疾病及癌症的关系，综述miRNA在疾病治疗中及作为生物标志物的应用研究。

microRNA；生物标志物；基因治疗

10年前，首个人类microRNA（miRNA）被发现。时至今日，据Thomson Reuters Integrity披露的数据显示，已有210个miRNA药物正处不同研发阶段（见表1）。2014年6月发布的miRBase序列数据库显示，在223个物种中，已收载了可表达35 828种成熟miRNA的28 645个前体miRNA词条。

表1 部分在研miRNA药物Table1 Some miRNA-based therapeutics under active development

续表1

1 miRNA简介

miRNA是长度约为21～24个核苷酸的一类非编码的小RNA分子，其与argonaute蛋白（RNA介导的基因沉默复合体中成分蛋白）一起共同参与mRNA沉默过程。1993年，miRNA首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中被发现。之后，在所有的生物体内，包括蠕虫、蝇、鱼、蛙、哺乳动物和开花植物，都发现有miRNA，且有些大型病毒也会产生miRNA。尽管通常情况下，在近亲物种中，miRNA较为保守，但在远亲物种中，miRNA有时也会具有同源性。比如，在秀丽隐杆线虫和人类间，let-7 miRNA具有100%保守性。这表明了miRNA在生物学上的重要性。许多miRNA具有多种拷贝或相关序列，并形成不同家族，如let-7、mir-515和mir-548家族。人类可能存在超过1 000种miRNA，它们广泛参与各种不同的生理过程，包括发育、分化、细胞增殖与凋亡、应激反应等。因此，miRNA的失调与很多疾病相关，如癌症、中枢神经系统（CNS）疾病、炎症、心血管疾病和代谢性疾病等。

2 miRNA的生物合成与功能

miRNA是由其基因通过RNA聚合酶Ⅱ而转录。最初的转录产物pri-miRNA是带有茎环结构（stemloop）的长分子前体，其茎环经RNase Ⅲ酶Drosha和辅助因子DGCR8的核切除，形成由大约70个核苷酸组成的pre-miRNA；随后，另一个RNase Ⅲ酶Dicer在细胞质内将pre-miRNA剪切，产生成熟的miRNA。成熟miRNA再与argonuate蛋白一起形成RNA介导的沉默复合体（RISC）。当带有互补序列的mRNA结合到RISC上后，经过降解或沉默，确保这些mRNA不再被翻译成蛋白（见图1）。

图1 miRNA的生物合成与功能示意图Figure 1 Schematic diagram of the biosynthesis and function of miRNA

与其他小核RNA（snRNA）不同，miRNA的沉默作用只需要miRNA和mRNA之间的部分互补，即6个碱基对就足矣。因此，一条单链miRNA能够使数百个基因沉默，而一个基因可被多条miRNA沉默，如miR-34a可抑制参与致癌细胞转化的多个基因。另外，相似的miRNA在不同的组织和不同的发育阶段，其表达也不相同。例如，一个miRNA可在发育早期阶段表达，但到后期则不表达。所以，一个miRNA的多个拷贝能根据需要同时调控多个不同的基因或单一基因。当多个不同的miRNA与同一靶mRNA结合，它们可协同降低靶mRNA水平，其作用大于单个miRNA作用的总和。miRNA的这种功能特点是基于靶识别，比如let-7g～let-7a1基因簇可识别3p2染色体位点，let-7f-1～let-7d 基因簇可识别9q22.3染色体位点，let-7a-2可识别11q23-q24染色体位点，let-7c可识别21q21染色体位点。由于这些染色体位点与一些实体癌相关，如肺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌，所以可靶向识别这些染色体位点的上述miRNA被认为能发挥抑制肿瘤的作用。根据生物信息学靶点预测，估计一个miRNA可识别1至数百个靶基因。

3 miRNA与疾病的关系

miRNA的突变可导致其功能丧失或增强，从而影响正常的翻译过程，并最终导致疾病的发生。miRNA突变可发生在体细胞或生殖细胞。已被检测到的基因畸变类型包括缺失、扩增和表观遗传改变。除了miRNA突变外，靶mRNA或经miRNA加工的蛋白的突变也会导致疾病。比如，miRNA生物合成酶Drosha的辅助因子DGCR8蛋白的缺失会导致miRNA的加工功能异常，而DGCR8结构域的单倍体缺损（haploinsufficiency）是DiGeorge综合征的诱因，因此可以说，miRNA参与了DiGeorge综合征的发生。另一个靶基因位点突变而导致疾病的例子是，SLITRK1的突变会影响到miR-189的结合，从而导致Tourette综合征。而另一种致病机制是一个基因获得一个新的miRNA靶序列。miRNA往往可特异性存在并作用于疾病的某个特定阶段，比如，miR-10b可调控肿瘤转移，且存在于高恶性乳腺癌组织中，但在癌症早期阶段，其似乎并无作用。表2介绍了在临床研究中用于不同疾病的miRNA。

4 miRNA与癌症的关系

miRNA与多种癌症相关，其可能呈现为抑癌或致癌基因。而定义一个miRNA是抑癌或致癌基因，取决于它的细胞或组织定位。例如，miR-221和miR-222可靶向作用于致癌基因KIT，因此它们在成红细胞中发挥抑癌基因功能；但是，它们也能靶向作用于抑癌基因PTEN、p27、p57和TIMP3，故又可成为致癌基因。Let-7在卵巢癌组织中可抑制致癌基因RAS、MYC和HMGA-2的表达，而在乳腺癌细胞中其表达减少，也同样发挥抑癌作用。miRNA-34家族是另一种抑癌基因，其在某些癌症组织中缺失。miRNA-15和-16也常在B细胞淋巴细胞白血病细胞中缺失，且在前列腺癌组织中的表达减少80%。其他已被深入研究的抑癌基因还有：miR-10b、miR-21、miR-26a、miR-126、miR-335和miR-29a。致癌基因则有miR-155和miR-17-92基因簇（包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b1和miR-92-1），其中，miR-17-92基因簇与多种实体瘤相关，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，且也与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关。miR-17-92基因簇的miRNA参与多个生理过程，如细胞增殖和凋亡以及血管生成，它们通过降低PTEN、p21和Bim等抑癌基因而发挥作用。表3介绍了已处临床研究后期的癌症相关miRNA。

表2 处在临床研究阶段用于各种疾病的miRNA*Table2 miRNAs in clinical study for various diseases

表3 已处临床研究后期的癌症相关miRNA*Table3 Cancer-related miRNAs in late stage clinical studies

5 miRNA用于治疗

由于单个miRNA可影响到参与单一通路的很多基因，基于miRNA的治疗药物要优于靶向作用于该通路中多个不同致癌基因的疗法。大多数miRNA药物属于两个类别：引入miRNA类（miRNA模拟物）和反义miRNA类（miRNA拮抗剂）。将miRNA引入体内，需要借助载体或脂质体。将miRNA递送至靶组织的载体通常有腺病毒、腺相关病毒（AAV）或逆转录病毒，而干细胞中独特的miRNA表达模式也可被利用。而且，可以选择一些表达所需miRNA的特定干细胞类型，并将其回输给患者。目前，Let-7模拟物正在被开发用于治疗多种实体癌，如肺癌和前列腺癌。可特异性作用于心脏的一种mir-208拮抗剂也正在被开发用于心血管疾病的治疗。用于丙型肝炎治疗的一种mir-122拮抗剂则已进入Ⅱ期临床试验。而唯一进入Ⅰ期临床试验的miRNA药物MRX34是抑癌基因miR-34的模拟物，正在被开发用于治疗不能手术的原发性肝癌或影响到肝脏的转移性癌症。

6 miRNA用作生物标志物

由于miRNA的表达与疾病相关，所以miRNA表达谱可用于患者分层和治疗方案的选择。例如，let-7和miR-122存在于肺癌组织中，而mir-208可用于心血管疾病的诊断。如前所述，miRNA具有组织和发育阶段特异性。而在不同体液中，miRNA也很稳定，且大多数循环miRNA能很容易通过PCR方法检测出来。这就使得miRNA成为非常有前途的无创性生物标志物。然而，由于面临技术上的挑战，miRNA开发用作生物标志物，已遇到不少阻碍。比如，因不同的miRNA中有保守序列，故引物设计可能会导致极为不同的结果；而且，因不同miRNA在体液中的含量都很低，且有较高的序列相似度及较短长度，所以微阵列（microarray）方法也不适用。不过，新一代测序（NGS）技术可以避免这些问题，因为它不再严重依赖于引物设计，但此项技术的引用可能较为昂贵。此外，miRNA样本的降解也是个问题，且缺乏miRNA的标准品制备和规范化方法。所有这些基本问题致使跨平台比较难以进行。当然，随着1 000多种潜在miRNA生物标志物的发现及对其生物学意义的认知，科学界一直在致力于解决这些挑战性问题。

7 结论

miRNA作为治疗靶点和生物标志物的价值已被公认。目前，有多个miRNA已经临床前验证，正待临床开发。眼下，亟需加强对更有效的miRNA药物递送系统的开发，以增加miRNA的体内吸收和稳定性，并促进miRNA药物的开发。而且，更进一步地探究miRNA在病理通路中的作用、明确它们的靶点以及相关技术的发展，将有助于推动miRNA生物标志物试剂盒进入临床。

MicroRNAs: from Biomarkers to Gene Therapy

Thomson Reuters

The value of miRNAs as therapeutic targets and biomarkers has been well established.In this article, the biosynthesis and function of miRNAs were introduced; the roles of miRNAs in disease and cancer were discussed; the researches on the applications of miRNAs in the treatment of diseases and as biomarkers were reviewed.

microRNA; biomarker; gene therapy

R362; R456

A

1001-5094（2015）03-0235-04