蛇足石杉形态解剖学与组织化学定位研究*

卢婧玮1，陈沈超1，冯晓燕1，周江俊1，张晓丹2，祁哲晨2，侯卓妮2，吕洪飞1,2

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004;2.浙江理工大学 生命科学学院,浙江 杭州 310018)



蛇足石杉形态解剖学与组织化学定位研究*

卢婧玮1，陈沈超1，冯晓燕1，周江俊1，张晓丹2，祁哲晨2，侯卓妮2，吕洪飞1,2

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004;2.浙江理工大学 生命科学学院,浙江 杭州 310018)

采用石蜡切片法，对蛇足石杉的不同器官进行了解剖学特征研究；结合冰冻切片法，用碘化铋钾、氯化铁染色法分别对蛇足石杉的根、茎和叶中的生物碱和黄酮类化合物进行了组织化学定位.结果表明：生物碱主要存在于蛇足石杉根和茎的中柱木质部和皮层的薄壁细胞中，少数存在于叶肉细胞及其胞间隙中，其含量大小顺序为：茎≈根>叶；黄酮类化合物主要存在于蛇足石杉的小型叶肉细胞及其胞间隙中，部分存在于根和茎的中柱韧皮部，含量大小顺序为：叶>茎≈根；在不同的器官中，生物碱和黄酮类化合物的含量存在差异，其中茎和根的生物碱含量较高，而叶中黄酮类化合物含量较高.

蛇足石杉；形态解剖；组织化学定位；生物碱；黄酮类化合物

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.) Trev.)属石杉科石杉属，又名蛇足草、金不换、万年杉等，植株小型，为多年生草本蕨类植物，分布广泛.蛇足石杉是一种珍贵的药用植物，民间用于治疗瘀血肿痛、内伤吐血、解毒止痛等[1].药理实验证明，蛇足石杉所含生物碱具有胆碱酯酶抑制作用，对肌肉有舒张和收缩作用，可提高学习记忆能力和改善记忆障碍；另外，临床研究表明石杉碱甲对于治疗老年性痴呆具有良好效果[1-4].有研究表明蛇足石杉中含有黄酮类化合物[5]，并有学者对其提取工艺进行了优化[6].近年来，黄酮类化合物因其具有重要的抗氧化、抗衰老和抗病毒等作用而受到广泛关注.药理实验表明,适量摄入黄酮类化合物能减少癌症、肿瘤、心血管疾病、脂质过氧化及骨质疏松等疾病的发病率[7].

由于蛇足石杉所含化学成分的药用价值逐渐被发现，人们越来越意识到蛇足石杉可以作为一种新药资源来开发利用.目前已有学者对蛇足石杉所含生物碱成分的提取与含量测定进行了相关研究[7-10].但是，关于总生物碱及黄酮类化合物在蛇足石杉不同部位中的分布规律，至今未见详细报道.作为一种与生物碱反应显色的试剂，Dragendorff试剂(碘化铋钾试剂)被广泛用于各类生物碱的鉴定[11-12]，而改良的碘化铋钾试剂可以更好地用于生物碱的鉴定和测定[13-16].本实验通过对蛇足石杉的形态解剖学研究，以及用改良的碘化铋钾法和5%氯化铁法分别对蛇足石杉中的生物碱和黄酮类化合物进行了定位研究，旨在阐明生物碱和黄酮类化合物在蛇足石杉不同器官中的分布，以期为其药材真伪鉴别、药物资源的开发利用及蛇足石杉的组织培养和科学栽培管理等提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

蛇足石杉全草采自浙江省金华市北山，经吕洪飞教授鉴定后栽培于浙江师范大学化学与生命科学学院的实验园地.

1.2 形态解剖学研究

用于结构观察的新鲜材料，经FAA固定液(V(福尔马林)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=5∶5∶90)固定，采用石蜡切片技术，切片厚度为10 μm，粘片、展片后采用番红-固绿对染，于Olympus BX 50光学显微镜下观察、摄影.

1.3 组织化学定位

用于组织化学定位研究的材料为新鲜的根、茎和叶，采用冰冻切片技术，切片厚度为10～12 μm，生物碱和黄酮类化合物分别经改良的碘化铋钾试剂[12]、5%氯化铁试剂染色，于Olympus BX 50光学显微镜下观察、摄影.

定性测定蛇足石杉的根、茎、叶中生物碱和黄酮类化合物的分布密度和颗粒大小：取不连续的冰冻切片比较观察，根据着色颗粒的分布密度和大小划分5个等级：+++++级，颗粒分布密度大、颗粒大；++++级，颗粒分布密度中等、颗粒大，或颗粒的分布密度大、颗粒大小中等；+++级，颗粒分布密度中等、颗粒大小中等，或颗粒分布密度大、颗粒小，或颗粒分布密度稀少、颗粒大；++级，颗粒分布密度稀少、颗粒大小中等；+级，颗粒分布密度稀少、颗粒小或无.

2 结果与分析

2.1 蛇足石杉的内部结构

2.1.1 根的石蜡切片

图1(a)和(b)为蛇足石杉根的石蜡切片，其横切面呈近圆形，由外至内为表皮、皮层和中柱.表皮细胞为1列轻微栓化的方形薄壁细胞，排列整齐且紧密.外皮层细胞为2～3列排列整齐、紧密的长方形薄壁细胞；中皮层由5～7列厚壁细胞组成，排列紧密，偶有细胞间隙；内皮层为3～5列薄壁细胞，排列紧密，无细胞间隙.维管柱为原生中柱，中柱鞘为1列长方形薄壁细胞，排列紧密.

2.1.2 茎的石蜡切片

图1(c)和(d)为蛇足石杉茎的石蜡切片，其横切面呈近圆形，分为表皮、皮层和中柱.表皮由1～3列长方形薄壁细胞组成，排列整齐紧密.表皮外附着有木栓化的死细胞残余.皮层发达，由外皮层、中皮层和内皮层构成：外皮层是厚壁细胞，排列紧密，无细胞间隙；中皮层为薄壁细胞，排列疏松，有较大的细胞间隙；内皮层明显，由1列薄壁细胞组成，排列紧密，无细胞间隙.中央有维管柱，维管柱的木质部向四周生长出辐射排列的倒三角形的脊状突起，形成星状中柱.

2.1.3 叶的石蜡切片

蛇足石杉叶由表皮、叶肉和叶脉组成，表皮外包被一层角质层.叶的上、下表皮均为1列长方形薄壁细胞.横切面观叶肉细胞由不规则细胞组成，细胞间隙较大，分化不明显(见图1(e)).

2.2 蛇足石杉根、茎、叶的改良碘化铋钾反应

对蛇足石杉的根、茎、叶冰冻切片进行改良的碘化铋钾反应，结果表明：根的冰冻切片中，根中柱的木质部有大量橘红色颗粒状沉淀(如图2中↑所示)，内外皮层之间的薄壁细胞中散见有橘红色颗粒状沉淀(见图2(a)和(b))；茎的冰冻切片中，茎中柱的木质部有较多的橘红色颗粒状沉淀，内外皮层之间的薄壁细胞中散见有橘红色颗粒状沉淀(见图2(c))；叶的冰冻切片中，叶肉细胞及胞间隙中可见细小的橘红色沉淀(见图2(d)和(e)).碘化铋钾染色显示生物碱的分布及含量在蛇足石杉的不同器官存在差异(见表1).

2.3 蛇足石杉根、茎、叶的氯化铁反应

对蛇足石杉的根、茎、叶冰冻切片进行氯化铁反应，结果表明：根的冰冻切片中，根中柱的木质部被染成深绿色(见图3(a)中↑所示)；茎的冰冻切片中，茎中柱的木质部被染成深绿色(见图3(b))；叶的冰冻切片中，在小型叶肉细胞及胞间隙中观察到大量的深绿色沉淀，其中胞间隙颜色较细胞壁浅(见图3(c)和(d)).氯化铁染色显示,黄酮类化合物的分布及含量在蛇足石杉不同器官存在一定的差异(见表1).

3 讨 论

3.1 蛇足石杉的形态解剖学特征

蛇足石杉的茎中皮层细胞排列疏松，有一定的细胞间隙，便于储存水分，反应茎结构对水分的适应性.研究发现，蛇足石杉茎的维管柱组织不发达，其木质部向四周生长出7个脊状突起，形成星散状.与黎有有等[17]对蛇足石杉茎木质部的观察结果基本一致.周毅等[18]研究发现5个居群的蛇足石杉木质部多数是6个或7个脊，也有出现4，5或8个脊的；而鲁润龙等[19]认为蛇足石杉的木质部是由6个辐射排列的脊状突起构成.这可能是由于蛇足石杉的木质部在不同的生态环境中存在着变异所致.

3.2 蛇足石杉的组织化学定位

根据对蛇足石杉的根、茎、叶所含生物碱进行组织化学定位可知，生物碱主要存在于蛇足石杉根和茎的中柱木质部和内外皮层之间的薄壁细胞中，含量大小顺序为茎≈根>叶.杜次等[10]对湘西蛇足石杉的总生物碱进行了测定，发现石杉碱甲和乙的分布均为叶>茎>根，石杉碱丙的分布则是根>叶和茎；而孙远明等[20]通过对不同产地蛇足石杉的不同部位所含石杉碱甲(Hup A)进行考察,并用RP-HPLC法检测了Hup A的含量，发现Hup A含量在蛇足石杉地上部分>地下部分，且不同地区含量有差异.由于蛇足石杉中生物碱单体种类有20多个[21]，本实验是对蛇足石杉根、茎、叶中生物碱总量进行组织化学定位，并没有确定具体单体的含量及其分布情况，因此与前人的研究结果并不矛盾.

黄酮类化合物经氯化铁反应后呈现出深绿色.蛇足石杉的根、茎、叶中黄酮类化合物的组织化学定位结果表明，蛇足石杉茎和根中柱韧皮部的总黄酮含量低于叶片中的，即黄酮类化合物以叶片中分布为主.这与鲁翠涛等[22]利用分光光度计对蛇足石杉茎叶内的黄酮类物质进行测定的结果一致.同时，文献[22]对千层塔叶片黄酮提取液进行各种定性颜色反应，初步判断其中的黄酮类物质主要为黄酮类和黄酮醇类.本实验中对蛇足石杉叶片所含黄酮类物质进行组织化学定位的颜色也有差异，可能是由于器官中含有不同的黄酮类物质引起的.

对蛇足石杉组织化学定位的研究结果表明，生物碱和黄酮类化合物的含量在蛇足石杉不同器官中存在差异.因此,可以根据不同的需要选择合适的部位进行组织培养.

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(责任编辑 薛 荣)

AnatomicalstructureandhistochemicallocalizationofHuperziaserrata

LU Jingwei1, CHEN Shenchao1, FENG Xiaoyan1, ZHOU Jiangjun1,ZHANG Xiaodan2, QI Zhechen2, HOU Zhuoni2, LÜ Hongfei1,2

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China; 2.SchoolofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversity,HangzhouZhejiang310018,China)

The paraffin sections were used to study the characteristics of morphological and anatomic structure; an improved dragendorff reagents (bismuth potassium iodide reagent) was used to locate the alkaloid in root, stem and leaf ofHuperziaserrata; the ferric chloride reagent was used to locate the flavonoid in root, stem and leaf ofH.serrata. The results showed that the color reaction and special crystal deposition sites indicated that the alkaloid was located in the stele xylem and parenchyma of root and stem, and mesophyll and its intercellular space of leaf. The alkaloid content in stem was almost equal to that in root, which was in general higher than that in leaf. The flavonoid was located in mesophyll and its intercellular space of leaf, the stele phloem of root and stem. The flavonoid content in stem was almost equal to that in root, which was in general lower than that in leaf. The alkaloid and flavonoid contents were obviously different among the different organs of the same species. The highest alkaloid content was in the stem and root, and the highest flavonoid content was found in the leaf based on these observation. The value of this study resided not only in indicating that different organs having different medicinal value, but also in providing theoretical basis of tissue culture and cultivation and the selection of medicinal parts forH.serrata.

Huperziaserrata; morphological and anatomic structure; histochemical localization; alkaloid; flavonoids

10.16218/j.issn.1001-5051.2015.04.015

2015-03-16；

：2015-03-26

浙江省科技特派员团队项目(2012T2T223)

卢婧玮(1990-)，女，河南濮阳人，硕士研究生.研究方向：资源植物学.

吕洪飞.E-mail: luhongfei0164@163.com

R931.6

：A

：1001-5051(2015)04-0447-05