运用Volocity软件分析T细胞与树突状细胞的动态相互作用*

程雪莲 李文文 孙志娜 梁昊岳 杨晚竹 冯晓明*

细胞图像处理技术是采用数字图像处理和计算机模式识别进行的显微图像定性和定量分析，在临床诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用，是生物医学工程领域的研究热点[1-2]。随着成像技术的发展，显微细胞图像已经从二维静态图像逐渐发展到二维序列图像及三维图像，但是这些图像在提供了更多信息的同时，也给传统细胞图像分析技术带来了挑战[3]。Volocity软件(PerkinElmer公司)是一款适用于三维和四维图像的高灵敏图像处理软件，不仅可获得非常好的信号检测，并具有强大的数据分析功能[4-5]。

树突状细胞(dendritic cell，DC)是已知机体内功能最强的抗原递呈细胞，其与T细胞的相互作用决定免疫应答的启动与否[6]。抗原识别过程中，两者会在细胞接触界面之间形成免疫突触，进而增强T细胞识别抗原的能力以及参与T细胞细胞因子分泌等[7-9]。细胞间作用对免疫系统具有重要的影响，准确的表征细胞间动态作用更加的迫切[10-11]。而随着科学仪器的发展、荧光染料的改进以及分析方法的开发(如量子点标记等)，将极大促进免疫研究领域的发展[12-13]。为此，本研究将流式细胞仪分选得到的DC和T细胞共同培养，使用PerkinElmer激光共聚焦显微镜进行拍摄，通过Volocity软件对两种细胞间动态作用进行分析，全面建立研究T细胞与DC的相互作用的方法。

1 材料与方法

1.1 设备与材料

(1)双转盘激光共聚焦显微镜(UltraVIEW，PerkinElmer，美国)、流式细胞仪(arriaⅢ，BD，美国)。

(2)C57BL/6J小鼠(SPF级)购自中国医学科学院血液学研究所实验动物中心；Biotin-anti-mouse CD3磁珠购自德国美天妮公司；APC-labeled Antimouse CD11c、PE-labeled Anti-mouse MHC均购自美国BD公司；CSFE染料和脂多糖购自美国Sigma公司；CellTrackerTMBlue CMAC Dye购自美国Invitrogen公司。

1.2 实验方法

采用颈椎脱臼法处死C57BL/6J小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，研磨后300目的无菌滤网过滤成单细胞悬液，分离淋巴细胞；通过免疫磁珠分选获得CD3+的T细胞。DC由流式细胞仪分选获得，将脾脏研磨后的单细胞悬液进行流式细胞分选，得到CD11c+MHCⅡ+的DC，对1 μg/ml的脂多糖诱导培养24 h后为成熟的DC。

1.3 激光共聚焦显微镜拍摄设置

将T细胞和DC分别标记CFSE(Sigma)和CellTrackerTMBlue CMAC Dye(Invitrogen)荧光染料。PerkinElmer激光共聚焦显微镜拍摄，拍摄条件为37 ℃，5%CO2，拍摄时间为30 min。分别选用488 nm激光(激光强度10%，300 ms)、405 nm激光(激光强度8%，820 ms)以及可见光(60 ms)进行拍摄，设置图像的分辨率为1000×1000。三维图像拍摄时Z轴间隔距离为1 μm，拍摄间隔时间为30 s。选用物镜放大倍数分别为20倍和60倍。

1.4 Volocity软件分析

Volocity软件分析步骤：①图像识别和细胞分割后，再进行具体参数分析。图像的识别是根据荧光阈值和检测面积进行检测条件设定；图像分割主要包括阈值分割、边缘检测及分水岭分割3种方法；②细胞的形态参数包括表面积、周长、形状因子、骨架长度及骨架直径等；③软件分析细胞运动轨迹包括细胞的位置、速度及接触时间等；④细胞的接触面积可通过Volocity软件自带程序直接完成。

2 实验结果

2.1 图像识别

使用Volocity对DC和T细胞识别是识别目标的荧光强度。首先设定荧光强度的阈值，高于阈值即为检测样品，低于阈值的即设定为背景。同时设定检测荧光区域的面积，小于该面积为杂质，大于该面积则为检测样品。通过调整Volocity软件识别荧光强度的阈值和检测面积的大小，使识别T细胞的数量由45个增加到61个，达到人工计数。然而，目前尚无一个金标准用来确定获得最佳的阈值和面积，因此细胞不规则、分辨率不同及不同实验人员分析等都将导致结果的不一致性[4-5](如图1所示)。

图1 Volocity对T细胞和DC识别成像图

2.2 DC形态分析

细胞形态是生物学活性和功能的重要表现形式，DC的形态变化可能与抗原递呈能力、促进B细胞的活化和调节体液免疫等功能相关[14]。基于Volocity软件对其研究，形状因子是细胞形态变化的重要参数(如图2所示)。

图2 细胞形状趋向图

图2显示，随着时间延长，DC的周长和面积的变化均无明显规律，但是DC的形状因子逐渐降低，细胞形状趋向于不规则。形状因子比周长和面积更加敏感，骨架长度和直径也是Volocity的两个重要参数，骨架长度为细胞中最长的轴，直径为与长轴垂直的最长的弦。两个参数可以反应细胞外形中心对称的程度，其不受平移、旋转等的影响。图2中骨架长度略有增长，骨架直径无明显的变化，形状趋向于不规则，与形状因子结果一致。离心率、曲率、基于径向半径差的细胞形变以及表面粗糙程度等参数也在其他软件中用于描述细胞形态的变化[15-16]。

2.3 Volocity软件和手动分析T细胞的运动轨迹

Volocity软件计算细胞轨迹包括图像的分割(轨迹的空间方面)和图像间的联系(时间方面)两个步骤[17](如图3所示)。

图3 手动和Volocity分析T细胞的运动轨迹图

图3a显示，T细胞在30 min内发生了明显的运动，部分细胞伸展伪足；图3b中手动和软件分析T细胞的总体运动轨迹和方向是一致的，但手动分析的运动距离明显偏大。9号T细胞是轨迹差别最大的细胞，经过分析发现随着曝光时间的延长，荧光强度逐渐低于检测阈值，软件无法对其进行识别，造成了两种分析方法的差异。8号T细胞的差异可能是与邻近细胞太近以致无法区分，造成实验结果的误差。剩余细胞也存在两种分析方法的部分差异，尽管手动分析细胞是计算细胞运动轨迹的金标准，但当研究大量细胞长时间的运动轨迹时，节约时间和重复性好等优点使软件分析成为首选[18]。但是由于采集的图像不均一、细胞密度高、细胞的重叠和粘连等原因会影响细胞的识别，给定量分析带来困难。

2.4 T细胞与DC的接触时间

细胞的接触时间是研究动态相互作用的重要特征，T细胞与DC的接触时间可能影响免疫功能，因其限制了MHC II类-肽复合物的数量[10]。Volocity软件识别视野内有61个T细胞，其中22个与DC接触，其余细胞处于流动状态。64%(14/22)接触时间＞400 s。接触时间包括连续接触时间和间歇性接触时间累加，结果显示，长时间接触是DC和T细胞作用的主要方式，更易促进突触的形成，加速免疫反应发生(如图4所示)。

图4 T细胞与DC接触时间柱状图

2.5 T细胞与DC的接触方式

通过三维成像对细胞突触类型进行分类，可分为未接触、松散接触和紧密接触(如图5所示)。

图5 三维分析T细胞与DC的接触方式示图

图5a和c呈现的是三维和二维成像的紧密接触，DC膜发生明显的凹陷，二维图像可观察到DC凹陷弧度，而图5b和d松散接触时未观察DC明显的形变。由此可知，不同T细胞与DC间的相互作用力也存在非常明显的差别，形成的突触类型不同，进而可能影响后续免疫反应的强弱。

2.6 T细胞与DC的接触体积

在研究细胞间存在紧密连接和松散连接的基础上，进而研究细胞的接触体积(如图6所示)。

图6 Volocity分析和定量T细胞与DC接触体积示图

图6显示，T细胞与DC发生明显的接触，最大接触体积为192 μm3。随着时间的延长，接触体积发生不规则的变化，T细胞与DC形成的突触是一个动态的结构。同时发现在30 min内形成免疫突触未消失，可能会启动后续的免疫反应。因此，对突触结构、形成过程及功能的进一步研究，将会更深入了解如何启动获得性免疫应答[19]。

3 讨论

本研究详细表征了T细胞与DC的动态相互作用，建立了系统表征两种细胞相互作用的方法，对细胞形态变化、运动轨迹、接触时间、接触方式和接触体积进行了总结，故该研究分析方法经过改进后可以应用于其他研究领域。T细胞与DC的动态相互作用是免疫研究的重要内容，T细胞与DC持续性的相互作用不仅是免疫反应的一个结果，更是自身的一个关键性的决定因素，短时间相互作用的特征是T细胞对抗原的识别，长时间相互作用将导致突触形成，但是目前大部分实验结果是通过流式细胞仪和免疫组化完成，缺少对这两种活细胞系统的动态表征方法[10]。

目前，市场上的分析软件主要有：Retrac，CellTrack，ImageJ，Imaris及Volocity等图像分析软件，这些软件由于分割方法、跟踪方式、运行平台以及输出类型等不同而分别应用于不同的研究领域[20]。其中高性能的Volocity特别适用于三维图像分析，且Volocity图像分析软件不仅可用于图像获取系统的图片分析，还支持市场上约90%图像获取平台获得的图片分析[5]。但是Volocity存在许多定量上的错误，如细胞不规则、荧光强度低、细胞密度高以及细胞重叠等都是Volocity分析产生误差的原因，因此使用Volocity分析结果时，需在实验前详细了解实验步骤以及准确的参数设置，减少不必要的误差，以获得相对准确的实验结果。

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