HPLC法测定通经活络喷雾剂中丹参酮ⅡA的含量

何广俊 李诗慧 王利胜 卢 映 李 周

（1 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2 广东省中医院药学部，广东 广州 510120）

通经活络喷雾剂处方由丹参、芦荟、黄连、黄芪、猫爪草等九味中药组成，具有活血止痛，舒经活络，清热解毒等功效，主要用于颈肩肌肉酸痛等症。通经活络喷雾剂处方中，丹参为君药，丹参酮ⅡA（TanⅡA）是丹参的主要脂溶性有效成分，具有明显的抗炎作用，对急性、亚急性关节肿有抑制作用[1]。为了控制通经活络喷雾剂质量，建立相应的质量标准，本试验参照2010版中国药典[2]，同时结合通经活络喷雾剂本身的特点建立了高效液相色谱法，用于测定君药丹参中丹参酮ⅡA的含量。

1 材 料

KQ5200DE型数控超声清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters 公司，515泵，2487紫外检测器）；N3000色谱工作站（浙江大学）；DLB200电子天平（日本岛津）；丹参酮ⅡA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0756-9908）；通经活络喷雾剂（自制，批号：121011、121012、121013）；阴性样品（自制）；色谱纯乙腈（迪马公司）；水为纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（75∶25）；检测波长为270 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量20 μL；出峰时间20.69 min；理论板数按丹参酮ⅡA峰计算不低于3000。色谱图见图1。

2.2 对照品储备液的制备：精密称取丹参酮ⅡA对照品1.2 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为12 μg/mL的储备液。

2.3 供试品与阴性样品溶液制备[3]：精密量取本品2 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理30 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；阴性溶液的制备是按处方中药味的比例，自配不含丹参的群药，按通经活络喷雾剂的制备工艺制成空白样品，其余操作与供试品的制备方法相同。

图1 通经活络喷雾剂的HPLC图

2.4 线性关系考察：取2.2项下丹参酮ⅡA储备液0.1、0.2、0.4、1.0、5.0 mL分别放入10 mL容量瓶中，定容并摇匀，制成浓度为0.12、0.24、0.48、1.2、6 μg/mL的系列标准溶液，精密吸取上述系列标准溶液20 μL，按照2.1项下色谱条件，依次进样，每个样品进样3次，以平均峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程Y=102959X-4680，r=0.9997。结果表明丹参酮ⅡA在0.12～6 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验：取1.2 μg/mL的对照品溶液20 μL，连续重复进样6次，测得藁本内酯峰面积并计算其RSD值。结果RSD为1.23%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验：取同一批样品（批号：121011），照前述方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别在0、2、4、8、12 h测定溶液中藁本内酯的峰面积，测得的峰面积并计算其RSD值。结果RSD值为2.32%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.7 回收率试验：取通经活络喷雾剂样品（批号121011）6份，精密量取1 mL，精密称定，依次分别每组精密丹参酮ⅡA对照品溶液（6 μg/mL×355 μL），依法制成供试品溶液，测定，计算回收率，平均回收率为99.94%，RSD为2.5%。由此可以得知该方法的回收率良好，适合含量测定的要求。

2.8 样品含量测定：按照2.3项下制备供试品溶液和2.1项下色谱条件测定3批样品，样品的含量测定结果为：批号分别为121011、121012、121013，测得的丹参酮ⅡA含量分别为2.134、2.156、2.273 μg/mL，RSD含量分别为0.98%、0.87%、0.75%。由此可见，3批通经活络喷雾剂成品中丹参酮ⅡA的含量相差较小，为了使制定的质量标准具有更好的适用性，因此规定通经活络喷雾剂中每1 mL含丹参含量以丹参酮ⅡA（C19H18O3）的总量计，不得少于0.15 μg。

3 讨 论

2010版中国药典及相关文献[4]中用HPLC法丹参酮ⅡA测定时，流动相为甲醇：水（75∶25），但是本试验用此流动相对丹参酮ⅡA进行测定时，丹参酮ⅡA峰型不是非常对称，因此本试验将流动相换成乙腈∶水（75∶25）进行试验，结果发现丹参酮ⅡA分离效果好，峰型对称，没有拖尾现象，因此最后选择的流动相为乙腈∶水（75∶25）。

在供试品的制备时，尝试过将通经活络喷雾剂直接过微孔滤膜，HPLC法测定，但是发现虽然用微孔滤膜过滤，供试品还是会有些堵塞预柱，可能是痛经活络喷雾剂是由中药复方提取制成，仍然存在一些大分子物质，因此本试验参考相关文献[4]将样品用甲醇处理以除去一些大分子物质，结果所得供试品溶液进行HPLC法进行测定时，柱压稳定，不再堵塞色谱柱。

[1]吴杲,何招兵,吴汉斌,等.丹参酮的药理作用的研究进展[J].现代中西医结合杂志,2005,14(10)：1382-1385.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社,2010：70-71.

[3]王希东,郝少君,李文俊,等.HPLC法测定益复康口服液中阿魏酸的含量[J].河南中医,2014,34(1)：154-155.

[4]吴俊洪,罗惠都,何丽冰,等.丹参酮Ⅱ纳米囊的制备及其性能评价[J].中药新药与临床药理,2013,24(1)：101-103.