UPLC法同时检测新疆葡萄酒中的7种单体酚

赵建勇，任水英

（国家农副产品监督检验中心（新疆），新疆 乌鲁木齐 830011）

UPLC法同时检测新疆葡萄酒中的7种单体酚

赵建勇，任水英

（国家农副产品监督检验中心（新疆），新疆 乌鲁木齐 830011）

建立了一种测定葡萄酒中7种单体酚含量的超高效液相色谱（UPLC）检测方法。采用ACQUITY BEH C18色谱柱，以甲醇/乙酸铵-乙酸缓冲溶液为流动相，0.2 mL/min梯度洗脱，变波长检测，各化合物线性关系较好（R2＞0.993），不同的添加水平的回收率在84.0%～108.4%范围，方法重复性较好（RSD≤6.08%）。该文利用UPLC法分析了不同地区、不同年份的葡萄酒中7种单体酚的含量，结果表明，葡萄酒中含有丰富的单体酚，单体酚的含量因酒样含糖量、品牌、厂家和原料产地不同而差别很大。

UPLC；葡萄酒；单体酚

葡萄中的多酚化合物对果实的色泽、风味以及葡萄酒的口感、营养价值都具有重要的作用，同时，多酚类化合物对一些严重危害人体健康的慢性疾病如肥胖、心脏病、癌症等具有一定的治疗或预防作用，在医疗、保健方面有着重要的利用价值[1-4]。所以对葡萄酒单体酚化合物的分析检测具有重要的意义。

然而，现行的葡萄酒检测标准中，并未制定出单体酚的限量指标[5]及检测方法[6]。由于缺乏特征性检测指标，当今葡萄酒鱼龙混杂，很多勾兑酒严重影响着消费者的身心健康。为此，为了鉴别葡萄酒的真假，近年来许多学者对葡萄酒中酚类物质的高效液相色谱分析方法进行了研究[7-11]。而超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）不但缩短了分析时间，同时也提高了分离度。本研究建立了葡萄酒中7种单体酚的UPLC检测方法，旨在探讨“真假葡萄酒的特征性指标群”，为真假葡萄酒的诊断和打假执法提供可靠的方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10个葡萄酒样品为本实验室检验用样品，含糖量（分为干型、半干型、甜型）、商标、厂家、原料产地均有不同。

咖啡酸、没食子酸、儿茶素、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素、山奈酚标准物质（纯度98.5%）：美国Sigma公司；甲醇（色谱级）：美国Fisher公司；乙酸铵、乙酸（优级纯）：天津市光复科技发展有限公司；乙酸乙酯（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters Acquity UPLCH-class超高压液相色谱仪：美国Waters公司；电子天平（0.1 mg）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UPHW型优普超纯水净化系统：成都超纯科技有限公司；IKARRV10旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液：准确称取各标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂配成1.00 mg/mL的标准储备溶液，4℃冷藏避光保存。

标准中间液：取上述标准储备液1 mL到50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，配成20μg/mL的混合中间标准溶液，4℃冷藏避光储存。

标准工作液的配制：用超纯水稀释混合中间标准溶液，得到系列标准混合工作液，质量浓度分别为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITYBEHC18（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；流动相：A（0.01 mol/L乙酸铵-乙酸缓冲溶）和B（甲醇），流动相梯度洗脱见表1。流速：0.2 mL/min；进样体积：10μL；柱温：30℃；波长：0～4.0 min，280 nm；4.0～7.0 min，320 nm；7.0～16.0 min，280 nm。

1.3.3 样品前处理

称取25 g（精确到0.01 g）混匀的葡萄酒，用25 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用旋转蒸发仪（＜40℃）浓缩近干后，甲醇∶水（4∶1，V/V）溶液定容5 mL，置于-4℃下避光保存，待液相分析用。进样前经0.22μm微孔滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

前处理是分析检测中一个非常重要的环节，直接影响着最终结果的准确性。文献中将样品pH值调节到2.0[12]或者7.0[13-14]再萃取，或者直接萃取3种方法[15]。本实验对3种方法进行了比较，结果表明，将pH值调节到7.0时，萃取速度缓慢，乳化现象严重，延长了处理时间；未调pH的样品和pH=2.0的样品萃取速度相当。将萃取液旋转蒸发后测试，发现同样的条件下，pH=2.0的样品基质较多。故本实验选择直接从样品中萃取。由于目标化合物均呈弱酸性，酒体本身也呈酸性（pH值约为4.0），可以使单体酚类物质以分子状态形式存在于酒体中，有利于有机相的萃取。

2.2 检测波长的选择

本实验采用二极管阵列检测器对7种单体酚进行波长扫描，扫描波段为200～400 nm。结果表明，除儿茶素和咖啡酸两种化合物最大吸收波长在320 nm之外，另外5种目标化合物在波长280 nm条件下均有较好的响应值，故本实验采用变波长扫描。在儿茶素和咖啡酸流出时间段扫描波长定在320 nm，其他分析时间检测波长均为280 nm。

2.3 流动相的选择

考察了常用的甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相，发现在此溶液洗脱时，保留时间存在着漂移，再现性不好。本实验将流动相改为甲醇/乙酸铵-乙酸缓冲溶液（pH=3.45），克服了pH值变化带来的影响，保留时间重现性好。

2.4 标准品、样品色谱图与标准曲线

将混合标准溶液及样品在确定的色谱条件下进行测试，得到7种混标以及样品的色谱图如图1所示。由图1可以看出，各组分分离效果好。

将5水平的标准溶液分别进样，根据质量浓度（X）和峰面积（Y）作标准曲线，7种目标化合物的线性方程及相关系数如表2所示，由表2可知，各化合物线性关系良好（R2＞0.993），仪器检出限低，此方法能满足定量分析的要求。

2.5 方法的回收率和检出限

对样品按照1.3.3前处理方法方法进行前处理，按照1.3.2色谱条件上机测试，每个水平平行分析2次，计算本方法的加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。结果如表3所示。结果表明，各化合物在不同的添加水平都得到了较满意的回收率（84.0%～108.4%）和较好的方法重复性（RSD≤6.08%）。

2.6 样品分析

从市场上抽取10个样品，采用本方法对样品进行处理、分析，其单体酚含量测定结果见表4。

从表4可知，10种样品中均含有丰富的单体酚，但不同样品中单体酚含量差别很大，尤其是没食子酸和儿茶素；单体酚的含量受酒样的品牌和生产地域影响较大，这可能是酿酒原料葡萄及酿造工艺的不同所致。

3 结论

建立了葡萄酒中7种单体酚的UPLC检测分析方法，以ACQUITY BEH C18色谱柱作为分离柱，以甲醇/乙酸铵-乙酸缓冲溶液（pH=3.45）为洗脱液，克服了pH值变化带来的影响，各目标化合物分离效果良好，在不同的添加水平都得到了较满意的回收率（84.0%～108.4%）和较好的方法重复性（RSD≤6.08%）。样品分析结果显示，葡萄酒中含有丰富的单体酚，各单体酚含量差异很大。葡萄酒中的含糖量、原料产地、酿造方式都会影响单体酚的含量。

[1]樊 玺，李记明.不同种酿酒葡萄酚类物质特性研究[J].中外葡萄与葡萄酒，2000（4）：13-15.

[2]BENVENUTIS,PELLATIF,MELEGARIM,etal.Polyphenols,anthocyanins,ascorbic acid,and radical scavenging activity of Rubus,Ribes and Aronia[J].J Food Sci,2004,69(3):164-169.

[3]CANTOS E,ESPIN JC,TOMAS-BARBERAN F A.Varietaldifferences among the polyphenol profiles of seven table grape cultivars studied by LC-DAD-MS-MS[J].J Agric Food Chem,2002,50(20):5691-5696.

[4]唐传核，彭志英.葡萄多酚类化合物以及生理功能[J].中外葡萄与葡萄酒，2000（2）：12-15.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫局、中国国家标准化管理委员会.GB 15037—2006葡萄酒[S].北京：中国标准出版社，2006.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫局、中国国家标准化管理委员会.GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.

[7]陈建业，温鹏飞，战吉成.葡萄酒中11种酚酸的反相高效液相色谱测定[J].中国食品学报，2006，6（6）：134-138.

[8]CASTELLAARI M,SARTINI E,FABIANI A,et al.Analysis of wine phenolics by high-performance liquid chromatography using a monolithic type column[J].J Chromatogr A,2002,973(1-2):221-227.

[9]REVILLA E,RYAN J M.Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extracts and wines by high performance liquid chromatography-photodiode array detection without sample preparation[J].J Chromatogr A,2000,881(1-2):461-469.

[10]FANG F,LI J M,PAN Q H.Determination of red wine flavonoids by HPLC and effectof aging[J].Food Chem,2007,101(1):428-433.

[11]裴 鹰，钱 洪.葡萄酒中的槲皮酮的保健功能[J].广州食品工业科技，2004，20（2）：140-142.

[12]成宇峰.葡萄与葡萄酒单体酚分析测定方法的研究[D].杨凌：西北农林科技大学硕士论文，2008.

[13]成宇峰，张振文，岳泰新，等.HPLC同时检测葡萄酒中10种单体酚的方法[J].食品科学，2008，29（4）：287-290.

[14]许婷婷，苏立强.葡萄酒中酚类物质的检测[J].化工时刊，2013，27 （1）：17-19.

[15]孙建平，侯小歌，梁 峰.高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法测定红葡萄酒中酚类物质[J].分析化学，2006，34（11）：1565-1569.

Determination of 7 mono-phenols in Xinjiang wines by UPLC

ZHAO Jianyong,RENShuiying

(National Quality Supervision Test Center of Agricultural Byproducts(Xinjiang),Urumqi 830011,China)

A UPLC method was developed for determining 7 mono-phenols in wines.The chromatographic separation was performed on an ACQUITY BEH C18column eluted with mobile phase of methanol/ammonium acetate-acetic acid mixture ata flow rate of 0.2 ml/min.The detection wavelength was variable with the change ofmaximum wavelength.The calibration curves of7 mono-phenols were linear with correlation coefficients more than 0.993,recovery rate 84.0%-108.4%,and the method repeatability was good(RSD≤6.08%).Differentaging times and different geographical origins of wine were determined.The results showed thatwine was rich in mono-phenols,and their contents were distinct with the difference of sugarcontent,brand,producer and geographicalorigins of raw materials.

UPLC;wine;mono-phenol

TQ201

A

0254-5071（2015）02-0139-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.031

2014-12-29

国家质检总局科研计划项目（2011QK385）

赵建勇（1973-），男，工程师，硕士研究生，主要从事食品检验工作。