白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白的分离纯化

巩子路，田童童，张 建，牛玉静，刘 娟，李 甜

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白的分离纯化

巩子路，田童童，张 建*，牛玉静，刘 娟，李 甜

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

利用单因素试验及响应面分析法将从白斑狗鱼鱼肉组织中获取的抗冻蛋白进行分离纯化。试验以鱼肉抗冻蛋白的热滞活性（THA）为响应值，对提取温度、pH值、提取时间、料液比4个因素进行优化。结果表明：白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白提取的最佳工艺条件为温度5.14℃、pH值8.40、提取时间为1.88 h，料液比1∶2（g∶mL），此时热滞活性达到0.061 2℃。验证试验结果显示热滞活性（THA）为（0.059 4±0.001 3）℃，与理论预测值基本吻合。经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-50分子筛层析柱纯化后获得了电泳纯的抗冻蛋白，其相对分子质量约为7.6 ku，热滞活性大约为（0.052±0.001 5）℃。

白斑狗鱼；抗冻蛋白；分离；纯化

抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是一类抑制冰晶生长的蛋白质，它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微。从而导致水溶液的熔点（melting point，MP）和冰点（freezing point，FP）之间出现差值，这种差值称为热滞活性（thermalhysteresis activity，THA）。因而抗冻蛋白亦称为热滞蛋白或温度迟滞蛋白（thermalhysteresis proteins，THPs）[1]。抗冻蛋白具有特殊的功能和热滞性质，能够降低冰点、抑制冰晶的生长和重结晶，修饰冰晶的形态[2]。抗冻蛋白广泛分布于鱼类、昆虫、植物以及微生物[3-6]中，DAVIES P L等[7]于1990年首先报道了鱼类AFP的生物化学特性和分子结构。随后的研究中，越来越多的AFP结构被发现，现已发现的5类AFP（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和AFGP）都具有THA。抗冻蛋白通过吸附到冰晶表面，由于Kelvin效应使冰晶的生长处于热力学上不利的状态，从而抑制冰晶的生长，保护避免结冰或者对结冰敏感的生命有机体免受结冰引起的伤害。由于抗冻蛋白具有阻止冰晶生长而不破坏细胞的特点，因而有望在食品原料的冷处理、冷冻食品的保鲜等方面发挥重大作用[8-11]。

本实验以生存于新疆北部额尔齐斯河流域的白斑狗鱼为研究对象，以鱼肉作为实验原材料，通过传统的分离方法，在单因素试验的基础上应用响应面分析法优化提取抗冻蛋白的工艺参数，并且通过阴离子交换柱层析及凝胶柱层析对抗冻蛋白进行纯化，以期为今后抗冻蛋白的发展与应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白斑狗鱼：购买于石河子市农贸市场；丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和四甲基乙二胺（tetramethylethylene-diamine，TEMED）：美国Sigma公司。三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、维生素C（vitamin C，VC）：中国医药集团上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

DEAE-Sepharose和Sephacryl S-500：美国GE-Healthcare Bio-Sciences AB公司；PVDF膜：美国Millipore公司；Mini-proteinⅢ：美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将从市场上购买的活体白斑狗鱼麻醉，再将其鱼肉组织从鱼体剥离，立即用液氮冷冻，置于组织捣碎机中进行粉碎，之后置于-70℃的超低温冰箱中保存备用。称取一定量处理好的鱼肉样品与等体积的Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）充分混合，于4℃冷藏箱中静置过夜。然后于5 000 r/min、4℃的条件下离心分离10 min，弃去沉淀，取上清液，并且将其进行冷冻干燥，所得干燥样品即为白斑狗鱼鱼肉抗冻蛋白粗品。

1.3.2 单因素试验

以Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作为提取液，将处理好的样品分别按照试验预设的不同料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）、不同pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，不同浸提温度-4℃、0℃、4℃、8℃、12℃和不同提取时间0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h等条件探讨分析各个单因素对鱼肉抗冻蛋白提取效果的影响。

1.3.3 提取工艺参数的优化

试验通过对可能影响鱼肉抗冻蛋白提取的4个因素[13]（料液比、pH值、提取温度和提取时间）进行详细的单因素试验分析。为了得到鱼肉抗冻蛋白提取的最优工艺参数，在单因素试验结果的基础上，以热滞活性（THA）（Y）为响应值，利用响应面分析法（response surface methodology，RSM）对鱼肉抗冻蛋白的提取进一步的优化[12]。响应面分析因素与水平编码如表1所示。

1.3.4 鱼肉抗冻蛋白的纯化

将所得到的鱼肉抗冻粗蛋白按照一定比例溶解于Tris-HCl（50 mmol/LTris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC，pH 7.5）缓冲液中，通过针孔滤膜（0.45μm）过滤后置于透析袋中过夜透析，期间更换透析液3～4次，然后将透析液进行超滤浓缩至一定浓度，通过阴离子柱进行层析分离，用4倍体积Tris-HCl（pH 7.5）洗脱，再用含0～0.8 mol/L NaCl的600 mL Tris-HCl进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，5 mL/管分管收集。紫外检测器的检测波长调节至280 nm。通过弱阴离子交换柱层析后具有活性的收集液用3 ku超滤膜进行超滤浓缩到5 mL，以待进一步纯化。

1.3.5 SDS-PAGE电泳

十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）参照CHALKLEY RJ等[15]报道的方法进行实验。样品与样品缓冲液按照1∶1（v/v）的比例混合，沸水浴5 min，上样量10μL，分离胶和浓缩胶的质量分数分别为12.0%和5%。样品分别在80 V和120 V恒压的条件下在凝胶中迁移，浓缩胶中迁移30 min后进入分离胶直到指示剂距离凝胶板边缘1 cm左右处停止电泳，整个电泳试验大概为3 h。从凝胶板取下电泳胶片，将其置于染色缸中于摇床上染色40 min，染色结束后于脱色液中脱色24 h，期间更换染色液4～5次。样品分子质量的确定根据标准蛋白Marker的相对迁移率计算获得。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响

利用缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC，pH 7.5）作为提取液，按照不同比例与冻干的白斑狗鱼鱼肉样品混合，其他条件保持在一个水平，探讨不同料液比对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图1所示。

由图1可知，白斑狗鱼鱼肉抗冻蛋白的热滞活性随着料液比的增加而上升，且在料液比为1∶4（g∶mL）时达到最高，其THA为（0.048 0±0.001 3）℃。继续增加料液比的比例，鱼肉中的抗冻蛋白的热滞活性呈现出明显的下降趋势。这可能是因为抗冻蛋白热滞活性的高低与抗冻蛋白的含量有一定的相关性，起初随着料液比增加，蛋白质也随着不断的溶出，含量随之而升高，因此热滞活性也越来越大，然而料液比过高，原料中总蛋白质含量是一定的，因此，抗冻蛋白含量会相对较低，故其热滞活性呈现下降的趋势。因此确定最佳料液比为1∶4（g∶mL）。

2.1.2 pH值对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响

利用不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作为提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）与冻干的鱼肉样品混合，其他条件保持在一个水平，探讨不同pH值对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图2所示。

由图2可知，随着pH值的不断上升，鱼肉中抗冻蛋白的热滞活性呈现不断上升的趋势，当pH值为8.0时，鱼肉抗冻蛋白的热滞活性达到最高，其THA值为（0.052 0± 0.002 4）℃。继续升高pH值，抗冻活性呈现出较缓慢的下降趋势。这主要是因为蛋白质在酸性溶液中溶解度低，碱性溶液中溶解度高而造成的。随着pH值增加，蛋白质溶解度在不断的增加，所以蛋白浓度逐渐升高，抗冻蛋白热滞活性也随之升高，然而，当pH值为9.0时，其热滞活性略微呈现下降的趋势，这可能是因为在碱性较强的环境下破坏了抗冻蛋白的空间结构从而导致其热滞活性下降。因此确定最佳提取pH值为8.0。

2.1.3 提取时间对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响

利用pH 8.0的缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作为提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）与冻干的鱼肉混合，其他条件保持在一个水平，探讨不同的提取时间对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图3所示。

由图3可知，随着时间的延长，鱼肉中抗冻蛋白的热滞活性也在不断的升高，当时间达到2.0 h，鱼肉抗冻蛋白热滞活性达到最高，其THA值为（0.055 0±0.001 8）℃。继续延长浸提时间，鱼肉抗冻蛋白的热滞活性基本保持不变，而THA值呈现出略微下降趋势。这可能与蛋白质在浸提液中的溶出速率有关，在2.0 h之前，鱼肉抗冻蛋白没有完全的溶解于浸提液中，因此随着时间的延长表现出热滞活性增加，而2.0 h之后，鱼肉的抗冻蛋白基本溶解完全，达到了最大浓度，所以热滞活性基本保持不变。因此确定2.0 h为最佳提取时间。

2.1.4 不同温度对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响

利用pH 8.0的缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作为提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）与冻干的鱼肉混合，提取时间设定为2.0 h，探讨不同提取温度对鱼肉抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图4所示。

由图4可知，随着温度的不断升高，鱼肉抗冻蛋白的热滞活性也在不断的上升，当温度升高至4℃时，热滞活性达到最高（0.065 0±0.002 4）℃。这可能是因为该鱼本身生活的特殊地理环境有关，尽管其生活在气候条件较寒冷的湖泊海域中，但是温度过低对其抗冻蛋白热滞活性也具有一定程度的影响。蛋白质在较高的温度下，其排列紧密的空间结构会变得松散，有利于蛋白质的溶出，从而会使其抗冻蛋白的含量不断增加，因此热滞活性也随之升高。然而抗冻蛋白的特殊属性使其在温度过高时会很大程度影响其原有的固有属性，其热滞活性呈现出下降的趋势。因此确定4℃为最佳提取温度。

2.2 响应面分析法结果分析

在单因素试验的基础上，为了得到更优的分离提取抗冻蛋白的工艺参数，利用Design-Expert8.0软件中的中心组合设计（center composite design，CCD）原理对4个单因素进一步优化。试验结果如表2所示，方差分析结果如表3所示。

当P＜0.05时，影响因素对响应值影响为差异显著，当P＜0.001 0时为差异高度显著，P＜0.000 1时为差异极显著。表3中显示模型的P=0.0002＜0.05，说明试验模型具有显著性，失拟项的P=0.076 7＞0.05，不显著，表明响应面设计的模型与实际试验拟合良好。由表3可知，X2的P=0.001 5＜0.05，表明pH值起着显著性的影响；X1的P=0.058＞0.05，说明影响不显著，说明温度的影响次于pH值。各个因素经过回归拟合后，经解得到的抗冻蛋白热滞活性的回归方程为：

通过软件求解方程，得出最优工艺条件为温度5.14℃、pH 8.40、提取时间为1.88 h，液料比1∶2（g∶mL），在此条件下，抗冻蛋白热滞活性达到0.061 2℃。为检验模型的可靠性，进行验证试验，结果显示热滞活性为（0.059 4±0.001 3）℃，与理论预测值基本吻合。

通过回归优化得出响应曲面及等高线[14]如图5所示。

等高线的形状反映交互效应的强弱大小。图形为网形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著。由图5A可知，随着pH值和温度不断增加，热滞活性也在逐渐升高。由图5B可以明显看出，温度对鱼肉中的抗冻蛋白的热滞活性具有较显著的影响。图5C可以明显看出，温度和料液比均显示出二次影响。随着温度和料液比不断升高，热滞活性呈现出先上升后下降的趋势。由图5D可知，曲面的坡度比较陡，说明二者之间的交互作用对抗冻蛋白的热滞活性的影响显著，该结果在表1方差分析中也得到验证。图5E可以看出，pH值和料液比对热滞活性都表现出二次效应，随着pH值和料液比的增加，热滞活性也在不断的上升，说明pH值和料液比交互作用对热滞活性的影响是显著的。图5F结果表明时间和料液比对抗冻蛋白的热滞活性均表现出二次效应。

2.3 白斑狗鱼鱼肉抗冻蛋白的分离纯化

白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白样品经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-50分子筛柱洗脱图谱分别如图6所示，鱼肉抗冻蛋白的电泳图谱如图7所示。

由图6A可知，鱼肉抗冻蛋白样品经过DEAE-Sepharose阴离子交换层析后得到一个较为明显的吸收峰，经电泳检测后显示该峰下的蛋白质为杂质蛋白，如图7A所示。将蛋白含量较高的收集管合并，超滤浓缩至5 mL，然后经过Sephadex G-50分子筛柱进行层析纯化。由图6B可知，凝胶层析后得到一个鱼肉抗冻蛋白吸收峰，经SDS-PAGE电泳检测得知该峰下的蛋白质为电泳纯的抗冻蛋白，且只含有一个亚基，其相对分子质量约为7.6 ku，如图7B所示。此时，测定该电泳纯的抗冻蛋白的THA约为（0.052 0±0.001 5）℃。

3 结论

白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白提取的最佳工艺条件为温度5.14℃、pH 8.40、提取时间1.88 h、料液比1∶2（g∶mL），此时热滞活性达到0.061 2℃。验证试验结果显示白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白的热滞活性为（0.059 4±0.001 3）℃，与理论预测值基本吻合。

利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-50分子筛层析柱对获得的抗冻蛋白粗品进一步的纯化，实验结果表明，白斑狗鱼鱼肉组织中的抗冻蛋白粗品经过阴离子交换柱层析后确实有一个较明显的蛋白吸收峰，但是经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测后，发现该处的抗冻蛋白样品为杂蛋白，电泳胶片上蛋白样品条带较多，未能达到电泳纯。将经过DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换柱所得的具有活性的蛋白收集合并，然后继续通过Sephadex G-50分子筛层析柱进行分离纯化，所得的层析图谱与阴离子柱层析的图谱相类似，同样有较明显的蛋白吸收峰，经SDS-PAGE检测发现，此处的蛋白样品达到电泳纯，且只含有一个亚基，根据标准蛋白Marker的相对迁移率计算获得其分子质量约为7.6 ku。同时，测定该电泳纯的抗冻蛋白的THA约为（0.052 0±0.001 5）℃。

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Isolation and purification of antifreeze protein from muscle tissues ofEsox lucius

GONG Zilu,TIANTongtong,ZHANGJian*,NIU Yujing,LIU Juan,LITian

(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Antifreeze protein(AFP)from muscle tissues of Esox lucius was isolated and purified by single factor experiment and response surface methodology.Furthermore,the extraction time,extraction temperature,extraction buffer pH and water to materialratio was comprehensively detected with thermalhysteresis activity(THA)as the evaluation index.Results showed thatthe THA of AFP from muscle tissues of E.lucius was up to 0.061 2℃under the optimized condition of extraction temperature 5.14℃,sample solutions pH 8.40,extraction time 1.88 h and solid to liquid ratio 1∶2(g∶ml).In addition,the verification experiment showed that the THA was(0.059 4±0.001 3)℃,similar to the experimentvalue.After DEAESepharose fastflow anion exchange column and Sephadex G-50 molecular chromatography column purification,AFP of electrophoresis level with 7.6 ku molecularweightwas obtained by furtherchromatographic purification,and the THA was about(0.052±0.001 5)℃.

Esox lucius;antifreeze protein;isolation;purification

Q51

A

0254-5071（2015）02-0120-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.027

2014-12-30

国家自然科学基金（31260366）；石河子大学青年骨干教师培训项目（3152SPXY01027）

巩子路（1990-），男，硕士研究生，研究方向为食品生物化学。

*通讯作者：张 建（1979-），男，副教授，博士，研究方向为食品生物化学研究工作。