柠檬总蛋白的提取工艺参数优化

宋小宁，杨文韬，李 桢，赵 军，李玉锋

（西华大学 生物工程学院，四川 成都 610039）

柠檬总蛋白的提取工艺参数优化

宋小宁，杨文韬，李 桢，赵 军，李玉锋*

（西华大学 生物工程学院，四川 成都 610039）

以柠檬为原料，通过单因素试验、正交试验，研究了不同因素对柠檬总蛋白提取的影响。结果表明，在磷酸缓冲液中蛋白质的溶解性较好，粗提取的最佳工艺为：硫酸铵饱和度80%，温度20℃，料液比1∶20（g∶mL），浸提时间4 h，在此条件下蛋白提取率是83%。因素对蛋白提取率的影响程度依次为：温度＞浸提时间＞料液比。

柠檬总蛋白；高效液相色谱；分离

柠檬（Citrus limon）是芸香科柑桔属常绿小乔木，是欧美国家主栽果树品种[1]。现主要产地为美国、意大利、西班牙和希腊。我国柠檬产量不足世界柠檬产量的1%，但四川柠檬的总产量占到了我国产量的80%以上[2-3]。目前国内外柠檬的加工利用主要是商品化鲜果、浓缩汁、柠檬香精油、柠檬果胶、蜜炼柠檬茶等休闲食品[4]。柠檬香精油主要用于食品，化妆品，医药和化工等行业[5]，研究发现柠檬香精油可以抑制黑曲霉和金黄色葡萄球菌等微生物，从而抑制食品腐败[6]。柠檬的食疗价值非常大，具有预防心血管疾病[7]、抗菌消炎、抗癌[8-11]、诱导HL-60肿瘤细胞凋亡[12]、延缓衰老抑制色素沉淀、降低动脉粥样硬化[13]等功效，柠檬富含维生素C和维生素P，能增强血管弹性和韧性，可预防和治疗高血压[14]。GHOLAMALIJ等[15]研究和探索了柠檬的降血糖作用，对糖尿病的治疗进展起到一定的推动作用。

本试验以尤力克柠檬为原料，研究了硫酸铵饱和度（硫酸铵的实际浓度：饱和硫酸铵的浓度）、浸提温度、浸提时间、料液比对柠檬总蛋白提取的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

尤力克新鲜柠檬：四川安岳县；硫酸铵、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸、硼酸、盐酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）均为分析纯：成都市科龙化工试剂厂；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国迪马DIKMA试剂公司；脂肪酶（来源于黑曲霉）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

AMR800B多功能食品加工机：中山市安蜜尔电器实业有限公司；HH-8恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂；LC-20AB高效液相色谱仪：日本岛津公司；PHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；5702R冷冻离心机：德国Eppendorf；BT12-D电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柠檬总蛋白的提取工艺流程与操作要点

鲜柠檬榨汁→过滤→浸提液提取→硫酸铵盐析→离心→冷冻干燥→粗蛋白

柠檬汁的制备：取3颗完整柠檬，加入榨汁机中榨汁15 min。将打碎的果肉组织先通过8层纱布过滤再通过16层纱布过滤，得到较澄清的柠檬汁，加入脂肪酶进行酶解，消除脂肪的干扰。

蛋白溶液的制备：向柠檬汁中分别加入4种不同的蛋白提取液，在不同温度下静置一段时间后，4℃，10 000×g冷冻离心，取上清液，得蛋白质溶液。

盐析：向蛋白溶液中加入饱和硫酸铵将蛋白质沉淀。沉淀得到的蛋白质经离心分离，冻干，得粗蛋白。通过凯氏定氮法检测粗蛋白中蛋白质含量。

1.3.2 提取工艺参数优化

通过单因素试验与正交试验设计，优化柠檬总蛋白提取参数。

（1）单因素试验设计：称取一定量的鲜柠檬汁，在不同稀释倍数的条件下加入适量的提取液，分别加热到一定的温度开始浸提。浸提不同时间后收集提取液，加入不同含量的硫酸铵进行盐析，以蛋白纯度和蛋白提取率为评价指标，考察不同因素对柠檬总蛋白提取的影响。

（2）正交试验设计：选取浸提温度（A）、浸提时间（B）、柠檬汁与磷酸缓冲溶液的比例（料液比）（C）3个因素，采用正交表L9（33）进行试验，正交试验因素与水平见表1。

1.3.3 蛋白提取率和蛋白纯度的测定方法

蛋白含量的测定采用凯氏定氮法，蛋白纯度计算公式如下：

1.3.4 柠檬蛋白及多肽的分离

以类胰岛素为参考标准品，以实验所得的柠檬总蛋白粗品为供试品，分别取1 mg加5%的乙腈水溶液配成蛋白溶液，低温离心10 min，取上清液，进行色谱分离。

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）条件：Sapphire C18（4.6 mm×150 mm，5μm）为色谱柱；流动相：A液为乙腈∶水=5∶95，0.05%三氟乙酸；B液为乙腈∶水=80∶20，0.05%三氟乙酸；梯度洗脱条件：0～1 min（85%A，15%B），1～50 min（50%A，50%B）。柱温30℃，检测波长220 nm，进样量10μL，流速0.8 mL/min。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸提液和pH对柠檬总蛋白提取的影响

分别以水、氯化钠溶液、Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液为提取液，在不同pH值条件下提取柠檬总蛋白，以蛋白提取率为指标，结果见图1。

由图1可知，4种浸提液的提取效果为：磷酸缓冲液＞Tris-盐酸缓冲液＞氯化钠溶液＞水，磷酸缓冲液提取柠檬总蛋白效果最好，因此选用磷酸缓冲液作为浸提液。同时由图1也可看出，在选取的几个pH值中，在pH值为7时蛋白提取率最高，提取率在pH值为6时最低，说明柠檬蛋白质的等电点在pH 6附近。考虑蛋白提取率及蛋白质在极酸和极碱环境下容易发生变质，在蛋白质溶解过程取pH值为7，在盐析过程取pH值为6。

2.1.2 浸提温度对柠檬总蛋白提取的影响研究

称取鲜柠檬汁10 g，浸提时间1 h，料液比1∶20（g∶mL），pH值为7，硫酸铵饱和度60%的条件下分别测定温度为4℃、10℃、20℃、30℃、40℃时蛋白纯度和蛋白提取率，结果见图2。

由图2可知，在4～20℃温度范围内升高温度有助于增强蛋白质的溶解性，提高蛋白提取率。20℃后，蛋白提取率随温度升高而下降。可能是由于温度高于20℃后，蛋白质可能发生变性，使蛋白质沉淀，而浸提液中的蛋白质含量降低。推断可能是因为温度升高增大了其他物质的溶解性，使提取到的蛋白质中含有其他杂质。因此综合考虑蛋白提取率和蛋白纯度，最适温度为20℃。

2.1.3 浸提时间对柠檬总蛋白提取的影响研究

称取鲜柠檬汁10 g，在温度为10℃，料液比为1∶20（g∶mL），pH值7，硫酸铵饱和度60%的条件下分别测定浸提时间为1 h、2 h、4 h、8 h、16 h时的蛋白纯度和蛋白提取率，结果见图3。

由图3可知，在1～4 h范围内随提取时间延长蛋白提取率显著增加，＞4 h后，随提取时间延长蛋白提取率无显著变化，但蛋白纯度在浸提时间为2 h时最高，＞2 h后随浸提时间的增长蛋白纯度略有下降后并保持稳定。因此在蛋白质的溶解过程应使蛋白提取率较大，同时考虑时间较长有可能会使部分蛋白质变性以及成本问题，选取4 h为最适浸提时间。

2.1.4 料液比对柠檬总蛋白提取的影响研究

称取鲜柠檬汁10 g，在温度10℃，提取时间1 h，pH值7，硫酸铵饱和度60%的条件下分别测定料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL）时蛋白纯度和蛋白提取率，结果见图4。

如图4所示，在一定范围内蛋白提取率随料液比的增大提取率而随之增大，但料液比＞1∶20（g∶mL）后，蛋白提取率不再增加，可能是由于增大料液比，蛋白质的溶解度增大，当蛋白质接近饱和后继续增加料液比蛋白质溶解度不再增加，而蛋白纯度随料液比增加先下降然后保持稳定。综合考虑选择最适料液比为1∶20（g∶mL）。

2.1.5 硫酸铵饱和度对柠檬总蛋白提取的影响

分别测定硫酸铵饱和度为20%、40%、60%、80%、100%时对柠檬总蛋白提取的影响，结果见图5。由图5可以看出，硫酸铵饱和度较大地影响柠檬总蛋白的提取，在盐析过程中随硫酸铵饱和度的增大，蛋白提取率随之增大，当硫酸铵饱和度＞80%时蛋白提取率开始下降。硫酸铵饱和度对蛋白纯度的影响不明显，因此盐析过程选择硫酸铵的饱和度为80%。

2.2 浸提工艺正交试验结果

选取浸提温度（A）、浸提时间（B）、料液比（C）作为正交试验因素，以蛋白提取率为评价指标进行正交试验，优化柠檬总蛋白提取参数，正交试验结果与分析见表2。

由表2可知，对提取效果影响的主次顺序依次为提取温度＞浸提时间＞料液比，其中浸提时间和料液比均对柠檬总蛋白提取效果影响较小，以蛋白提取率为考察指标，最优组合为为A2B2C2。即最佳条件是温度20℃，提取时间4 h，料液比1∶20（g∶mL），在最佳浸提条件下进行验证试验，柠檬蛋白提取率为83%。由表3可知，根据各变异来源F比与F临界值对比，温度为最显著因素，时间和料液比为不显著因素。因素的主次顺序为温度＞时间＞料液比。

2.3 柠檬总蛋白质及多肽的HPLC分析

HPLC法测得的类胰岛素标准品色谱图和供试品色谱图见图6。由图6A可知，类胰岛素标准品保留时间为7 min，从图6B可看出柠檬蛋白质也在相同保留时间出现色谱峰。这样看来柠檬多肽中含有与类胰岛素结构相似的物质。

3 结论

通过试验确定了柠檬总蛋白提取的最佳提取工艺条件为硫酸铵饱和度80%，提取温度20℃，料液比1∶20（g∶mL），提取时间4 h。该条件下蛋白质提取率为83%，且费用低，可应用于柠檬副产物的工业化生产。

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Optimization of process parameters for lemon protein extraction

SONGXiaoning,YANGWentao,LIZhen,ZHAOJun,LIYufeng*

(School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

Using lemon as raw material,the effectof differentfactors on lemon protein extraction was evaluated by single factor testand orthogonal test.The results showed thatthe solubility ofthe protein in phosphate buffer was the optimal.The optimalextraction process was ammonium sulfate concentration 80%,temperature 20℃,solid-liquid ratio 1∶20(g∶ml),extraction time 4 h.Under these conditions,the extraction ratio was 83%.The factors influencing the protein extraction rate in orderwas temperature,extraction time,solid-liquid ratio.

lemon protein;high performance liquid chromatography;isolation

TQ936

A

0254-5071（2015）02-0043-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.010

2015-01-10

国家级星火计划课题（2013GA810002）

宋小宁（1988-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：李玉锋（1965-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。