人牙周膜成纤维细胞的生物力学研究

张春艳，郭大伟，宋玲，刘文，于江波，袁晓

山东省青岛市市立医院口腔医疗中心，山东青岛266071

人牙周膜成纤维细胞的生物力学研究

张春艳，郭大伟，宋玲，刘文，于江波，袁晓

山东省青岛市市立医院口腔医疗中心，山东青岛266071

人牙周膜成纤维细胞是牙周膜中的主要细胞，参与调节牙周组织的改建和再生。临床上咬合创伤、正畸治疗及各种修复体行使功能时，各种作用力通过牙体传递到牙周，引起牙周膜的一系列生物学改变。因而作为牙周膜的主要功能细胞—牙周膜成纤维细胞（Human Periodontal liqament Fibroblasts，hPDLFs）的体外生物力学研究，对临床治疗起着重要的指导意义。该研究从hpDLFs的生长特征、蛋白质合成、标志性酶及细胞因子、信号转导方面对目前的hpDLfs的生物力学研究做一综述。

牙周膜成纤维细胞；生物力学；研究

人牙周膜成纤维细胞是牙周膜中的主要细胞，该细胞具有合成降解胶原，受诱导多向分化的能力，而且还通过合成分泌多种因子与酶,参与调节牙周组织的改建和再生。临床上咬合创伤、正畸治疗及各种修复体行使功能时，各种作用力通过牙体传递到牙周，引起牙周膜的一系列生物学改变。因而作为牙周膜的主要功能细胞—牙周膜成纤维细胞（Human Periodontal liqament Fibroblasts，hPDLFs）的体外生物力学研究，对临床治疗起着重要的指导意义。该研究从hpDLFs的生长特征、蛋白质合成、标志性酶及细胞因子、信号转导方面对目前的hpDLfs的生物力学研究做一综述。

1 hPDLFs的生长增值

加载装置的不同、应用大小、应力频率的不同，hPDLFs增殖活性的改变也不尽相同。王永等[1]对hPDLFs施加机械牵张力，结果发现一定力值范围的机械张力能促进hPDLFs增殖活性，过大力值的牵张力反而抑制细胞增殖。周继祥等[2]利用自行设计的膜式动态张应力-体外细胞研究体系对hPDLFs分别进行静张应力及不同频动范围动态张应力加载，结果发现不同张应力对hPDLFs的增值活性影响明显不同，静张应力有明显的促hPDLFs增值作用而动态张应力有一定的抑制作用。体外加力时间的不同[3]，同样也影响到细胞的增殖，在一定时间范围内，周期性张应力可促进hPDLFs的增殖，但随着时间的延长，增殖会受到抑制。在众多研究中，加力方式、加力大小、加力时间的不同，均会引起hPDLFs增殖或抑制等不同的变化，牙周膜受力的复杂性决定了体外模拟实验的多样性。

2 hPDLFs胶原纤维及蛋白质合成

人牙周膜成纤维细胞具有合成、分泌胶原蛋白功能，其胶原纤维合成情况可以反映牙周膜细胞外基质的新陈代谢。Howard等[4]研究发现5%的拉伸应变条件下，I型胶原合成增加而10%应变则无明显影响，说明hPDLFs对不同的机械力刺激产生不同的反应，从而影响了细胞外基质的合成，以适应外力的刺激。同样赵志河[5]研究发现不同频动范围的动态张应力对hPDLFs胶原纤维合成的影响截然不同，适当频动范围的动态张应力更有效的促进胶原纤维的合成而静态张应力作用并不能增加hPDLFs的胶原纤维合成。2种作用力对胶原纤维合成影响差异可能是导致细胞形变的不同引起的[6]。对体外培养的hPDLFs施以动态张应力，较小的张应力使hPDLFs纤连蛋白mRNA表达随加力时间延长逐渐增加，较大张应力使hPDLFs纤连蛋白表达先增加后减少[7]。体内环境下胶原纤维和蛋白是细胞外基质的重要组成部分，hPDLFs受力时，细胞外基质会产生相应的破坏和改建，并通过膜蛋白传导到细胞内。

3 hPDLFs的细胞因子及酶

碱性磷酸酶（alkalline phosphates,ALP）是参与骨组织钙化过程中关键性蛋白酶。Alp活性较高则表示该组织具有较强的钙化及成骨功能。PDLFs具有较高水平的ALP活性，其碱性磷酸酶活性是牙龈成纤维的10倍。Yamaguchi M[8]等研究发现人牙周膜细胞在在同期性外力的作用下（24%elongation），ALP活动显著降低，并且发现ALP活性的降低主要靠PGE2和IL-1调节的。张宇[9]等利用液压加载系统对hPDLFs施加压力发现，hPDLFs对压力具有一定的耐受性，但当压力增加到一定程度时，随着作用时间延长造成ALP活性降低，压力较大会短时间内造成ALP活性降低运以说明过大的咬合力或矫治力，将会影响ALP活性降低，影响牙周组织钙化，并导致牙周组织的一系列病变。

牙周膜细胞是具有异质性的细胞群，受到刺激或加入某些诱导条件下，细胞会分化成具有成骨特性的细胞，从而引起牙槽骨的吸收和形成。hPDLFs是正畸牙移动过程中受力的直接效应细胞，因而在牙槽骨改建中起着关键的作用。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）是基质矿化的调节基因，OPNmRNA在成骨细胞分化的早期即开始表达，可以作为成骨样细胞分化的早期标志。骨钙素(osteo calcin,OC)是细胞外基质蛋白，它是成骨细胞成熟的标志。研究发现，hPDLFs在受到机械牵张力刺激作用下，OPN和OC均增殖，提示hPDLFs在机械力诱导下向成骨样细胞分化，从而在机械力介导的牙槽骨改建中发挥重要的作用[10-11]。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）是一类水解基底膜和细胞外基质的蛋白水解酶家族。MMP通过降解胶原而参与牙周组织的力学改建。彭庭莉[12]等对hPDLFs施加动态张应力，观察其MMP的分泌情况，结果发现hPDLFs受到动态张应力作用后MMP-9表达有不同程度的增加，当细胞受到5KpaN-0-N5Kpa动态作用力后表达明显增加。该结果提示，恰当的张应力作用可以明显促进MMP-9生成，从而加速牙周膜的改进，这对临床选择最适矫治力提供了可靠的依据。MMP-2能降解IV型胶原纤维，该纤维是基底细胞膜的主要成分。正畸过程中，牙周组织吸收和重建，MMP-2起着重要的作用。对hPDLFs施加持续机械张应力可诱导MMP-2表达的增加，从而影响牙周细胞外基质的代谢[13]。

在机械力刺激下，hPDLFs能够合成并分泌多种细胞因子，从而调节参与了牙周组织的改建和修复。TGF-β1作为损伤修复过程中的重要生物介质，对牙周软硬组织再生修复都有重要作用。TGF-β1能促进hPDLFs的增殖，能促进蛋白质和RNA的合成[14]，还能促进hPDLFs产生细胞外基质，因而研究外力作用对hPDLFs的TGF-β1表达的影响，具有极其重要的意义。汤楚华等[15]采用液压细胞加载装置对hPDLFs施加不同等级的压力，结果发现，hPDLFs合成TGF-β1受到机械压力的调控，在一定载荷范围内，hPDLFs合成TGF-β1量随着压力增大而降低。该研究提示机械压力可能通过对hPDLFs的TGF-β1表达的影响，调节细胞的增殖、细胞外基质的降解过程，从而引起牙周组织的改建。Kimoto S[16]等应用Flexercell细胞拉伸装置，对hPDLFs施加5%的拉伸应变，每分钟3次，结果发现恒牙来源的hPDLFs的TGF-β1合成显著增多hPDLFs，表明hPDLFs在外力作用下通过合成分泌细胞因子的参与了牙周组织的改建。

4 信号转导途径

无论在临床正畸过程中还是咬合创伤时，外力的刺激传导到牙周膜的hPDLFs，引起牙周膜的一系列改建。力学信号是如何传导致效应细胞呢？这就涉及到机械力学信号传导路径的问题。多种生物化学信号参与了正畸力下牙槽骨改建。

丝裂原活化蛋白激酶级联（mitogen actirated protein Kinase,MAPK）是细胞内主要的传导系统。MAPK信号传导系统有多条信号通道，p38MAPK是比较经典的一条。当受到外界刺激时，细胞内p38MAPK由非磷酸化转为磷酸化状态而活化，它可促进下游底物的磷酸化来快速实现信号的传递，也可以通过转位入胞核活化转录因子调控特殊基因的表达，从而将信号从胞外传导到胞核。党平等[17]应用可控压力细胞加载装置，观察压力作用下hPDLFs内p38MAPK激活的强度变化，结果发现当压力值为200 Kpa时，细胞内p38MAPK磷酸化程度明显增强，约60min后磷酸化水平降至刺激前水平，初步证明机械力信号可通过跨膜转导激活p38MAPK，引起牙周膜细胞

功能改变，导致牙周组织改建。对hPDLFs施加周期性张应力时发现，加入p38MAPK特异性抑制剂可抑制hPDLFs细胞增殖，并能抑制周期性张应力引起的增殖细胞核抗原mRNA的表达，证明p38MAPK信号通道在周期性张应力介导的hPDLFs增殖中发挥重要的作用[4]。

细胞外信号调节激酶ERK（extracellular sigal-regulated kinase）信号通路是另一条重要的MAPK信号转导途径。Kook SH等研究发现机械力通过促进骨保护素的产生而抑制hPDLFs向破骨细胞的转化，ERK信号通路参与其中[18]。ERK1/2是ERK的活性形式，可进入细胞核，通过磷酸化活化转录因子，调控细胞增殖和分化。有研究发现，ERK1/2信号通路介导机械力作用下hPDLFs的增殖调控及促进BMP-2的表达[19]。

RAS同源基因(Ras homologgene,Rho)是细胞骨架的主要组成成分，可以调节肌动蛋白应力纤维，通过激活Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶等一系列反应，在应力介导hPDLFs细胞骨架重排中发挥作用。hPDLFs受到正畸力的作用后，会发生细胞骨架的重排和转移，从而对应力产生反应。Rock是Rho家族的下游信号分子，研究发现[20]，周期性张应力作用下ROCK蛋白的表达增强，Rock的特异性抑制剂可以降低其表达和细胞骨架的重排，从而推断周期性张应力促进细胞骨架的重排中Rho信号通路参与了此过程。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB或Akt）信号通路是调控细胞增殖、凋亡的重要信号转导通路之一。PI3K与相应的配体（如生长因子）结合后能发生自身酪氨酸残基的磷酸化，能磷酸化细胞膜上的PKB，激活Akt,调控许多细胞与细胞代谢、凋亡、增殖有关的蛋白，从而发挥抗细胞凋亡的作用。研究发现[21]PI3K/Akt信号通路参与了张应力介导的hPDLFs细胞的凋亡。

总之，hPDLFs的体外生物力学研究虽有大量的报道，但由于多方面的原因，出现的结果不尽相同。比如，在细胞的来源方面，有利用组织块法培养的牙周膜细胞，有的是酶消化法培养的，还有的利用传代的牙周膜成纤维细胞珠。细胞加载装置也不尽相同，所以施力的标准不同，施力的方式不同，研究结果自然有一定的差异。该研究认为应选用最具有代表性的细胞株来研究，选用与临床上合力或正畸力最接近的力学加载装置，研究的结果才更有利用价值。

[1]Wang Y,Jia Y,Zhao ZH,et al.Effects of mechanical stress on the proliferation kinetics of the human periodontal fibroblast cells in vitro[J].Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi,2005,23(4)：332-334.

[2]周继祥,赵志河,谭理军，等.体外不同张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖活性的影响[J].四川大学学报：医学版,2003,34 (4):638-640.

[3]曹海萌，张广耘，袁晓，等.p38丝裂素活化蛋白激酶与周期性张应力介导牙周膜成纤维细胞的增殖[J].中国组织工程研究，2012,16(28):5241-5245.

[4]Howard PS,Kucich U,Talwal R，et al.Mechanical forces alter extracellularmatrix synthesis by human periontal ligament fibroblasts[J].J Periodontal Res,1998，33(8):500-508.

[5]赵志河，周继祥，江凌勇，等.体外不同张力对人牙周膜成纤维细胞胶原纤维合成的影响[J].四川大学学报：医学版，2003,34(4):635-637.

[6]MacKenna D,Summerour SR,Villarreal F.Role of mechanical factors in modulating cardiac fibrollast function and extracellularmatrix synthesis[J].Cardiovas Res,2000，46(2):257-263.

[7]朱庆党,刘丽，杨艳丽，等.张应力刺激下人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素、细胞骨架的变化[J].上海口腔医学, 2010,19(6):601-606.

[8]Yamaguchi M,shimizu N,shibata Y,et al.Effect of different magnitudes of tension force on alkaline phosphatase activity in periodont ligment cell[J].J Dent Res,1996,75(3):889-894.

[9]张宇，施生根，张慧.压力环境对人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响[J].第一军医大学学报，2001,21(10): 767-769.

[10]Li X,Zhang D,Fu M,et al.Effects of mechanical stretching force on osteoblast-like function of human periodontal ligament cells in vitro[J].Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 2002,37(2):135-138.

[11]Yang YQ，Li XT,Rabie AB,et al.Human periodontal ligament cells express osteoblastic phenotypes under intermittent force loading in vitro[J].Front Biosci,2006（11）:776-781.

[12]彭庭莉，周继祥，杨军.动态张应力作用下人牙周膜成纤维细胞分泌MMP-9的实验研究[J].重庆医学，2005,34（12）：1810-1814.

[13]刘名燕，李燕，冯云霞.牵张应力对人牙周膜细胞MMP-2表达的影响及相关信号通路的研究[J].临床口腔医学杂志，2014，30(5):286-289.

[14]Brady TA,Piesco NP,Buckley MJ.Autoregulation of periodontal ligment cell phenotype and function by transforminggrowth factorbeta[J].J Dent Res,1998,77(10):1779-1790.

[15]汤楚华，施生根，牛忠英,等.机械压力对人牙周膜成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响[J].口腔颌面修复学杂志，2007，8（2）：87-89。

[16]Kmoto S,Matsuzaw a，Matsubara S,et al.Cytokine secretion of periontal ligment fibroblasts derived from human deciduous teeth:effect of mechanical stress on the secretion of transforminggrowth factor-beta 1 and macrophage colony stimulating factor[J].J periodontal Res，1999,34(5):235-243.

[17]党平，施生根，宋应亮.机械力诱导牙周膜成纤维细胞P38MAPK磷酸化反应实验研究[J].牙体牙髓牙周膜病学杂志，2003，12（4）：202-204.

[18]Kook SH,Son YO,Hwang JM,et al.Mechanical force inhibits osteoclastogenic potential of human periodontal ligament fibroblasts through opg production And erk-mediated signaling[J].J Cell Biochem,2009,106(6):1010-1019.

[19]Suzuki R,Nemoto E,Shimauchi H.Cyclic tensile force upregulates BMP-2 expression through MAP kinase and Cox-2/PGE2 signaling pathways in human Periodontal ligament cells[J].Exp Cell Res，2014,323(1):232-241.

[20]潘劲松，王莉，汪延乐，等.Rho信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜细胞骨架重排中的作用[J].广东牙病防治，2014,22（6）：289-293.

[21]尹崇英，张广耘，袁晓，等.周期性张应力对牙周膜成纤维细胞凋亡的影响（英文）[J].现代生物医学进展，2012,12(15): 2847-2851.

R78

A

1672-5654（2015）08（c）-0195-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2015.24.195

2015-05-25）

张春艳（1977.9-），女，山东青岛人，硕士学位。

袁晓，男，博士后，主任医师。